גזירת מבשרי neuroepithelial מ עובריים (ES) בתאי גזע באמצעות פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
לתאי גזע עובריים יש פוטנציאל להתמיין לתאי מכל שכבות נבט, מה שהופך אותם לכלי אטרקטיבי לפיתוח טיפולים חדשים. באופן כללי, התמיינות של תאים עובריים מלווה את המושג ראשית ליצור ובתאים לא בשלה, אשר לאחר מכן ניתן מופצות הבדיל לתוך פנוטיפים הסלולר בוגרת. זה חל גם על neurogenesis תא הנגזרות ES, שבו את התפתחותם של תאים עצביים בעקבות שני שלבים עיקריים: ראשית, גזירת והרחבת מבשרי neuroepithelial בשלה בידול השני שלהם לתוך תאים עצביים בוגרת. שיטה נפוצה כדי לייצר אבות עצביים מתאי גזע עובריים מבוסס על היווצרות embryoid הגוף (EB), אשר חושף את התמיינות של תאים מכל שכבות נבט כולל neuroectoderm. שיטה חלופית ויעילה יותר כדי לגרום להתפתחות התא neuroepithelial משתמשת פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA), אשר ניתן להשיג על ידי שיתוף culturing תאים ES עם מח עצם הגולגולת שמקורם בתאי סטרומה (1). שניהם, היווצרות EB ו SDIA, לחשוף את הפיתוח של רוזטה כמו מבנים, אשר נחשבים דומים עצביים צינור ו / או עצביים לפסגה, כמו אבות. מבשרי עצביים יכולים להיות מבודדים, התרחבה מובחן יותר לתוך נוירונים ספציפיים בתאי גליה תנאי שימוש תרבות מוגדרת. כאן, אנו מתארים את הדור ובידוד של רוזטות כאלה שיתוף תרבות ניסויים עם קו תא סטרומה MS5 (2-5).
פרוטוקול
שלב 1
- Mitomycin-C-פלייט ggrowth עכבות (10 מיקרוגרם / מ"ל במשך 2.5 שעות) MS5 תאים בצפיפות של 70,000 / CM2 על ג'לטין מצופה (0.01% במשך 30 דקות) 6 צלחות היטב α-ממ התקשורת.
- כאשר תאים המחוברים ואת יצרו monolayer (מעל צמיחה לילה), לעבור SRM.
- ידנית לבודד תאים עובריים מושבות של תאים ES תרבויות באמצעות מזרק בעל מחט 27 ½ G.
- Tritrurate המושבות בזהירות עם קצה כחול 1 מ"ל ו צלחת בצפיפות נמוכה על MS5 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים ליצירת ובידוד neuroepithelial תאים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות SDIA. יישום של שיטה זו הוא סעפת נעשה שימוש בפרוטוקולים רבים לייצר נוירונים המצוין (למשל 1, 2, 5-9). רוזטות נחשבים דומים התאים בצינור העצבי עם פנוטיפ קדמית (2, 5, 10), מכילים גם אבות הרכס העצבי (11, 12). בנוסף, הם שומרים על רמה מסוימת של גמישות, כיוון שהם יכולים להיות בדוגמת על ידי גורמים מסוימים בתנאים תרבות מוגדרת. לפיכך, SDIA הנגזרות אבות עצביים יכול להצמיח סוגי תאים רבים ממערכת העצבים המרכזית היקפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| פניסלין/סטפטומיצין | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| תחליף סרום Knockout | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| תמיסת חומצות שומשניות לא חיוניות של MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| תוסף N2-A | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| ג'לטין מסוג A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | תמיסת 0.01% | |
| למינין | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| פיברונקטין | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| גורם גדילה בסיסי לפיברובלסטים (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| מזרק 1 mL עם מחט 27 1/2 G | BD Biosciences | 309623 | ||
| מדיום N2-A | מדיום | DMEM/F12 + 1% תוסף N2-A | ||
| מדיום תחליף סרום (SRM) | מדיום | Knockout-DMEM + 20% תחליף סרום Knockout + 1% תמיסת חומצות שומשניות לא חיוניות של MEM + 2 mM L-glutamine | ||
| מדיום α-MEM | מדיום | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% פניסלין/סטפטומיצין | ||
| MS5 | שורת תאים | תאי סטרומה | ||
| מיקרוסקופ | ||||
| פלטות 6 בארות | לתרבית רקמה |
מקורות
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
