Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

סיכום

האפיתל באוזן הפנימית החושית של דג הזברה מבוגר היא מערכת מודל טוב להבנת מנגנוני התחדשות התאים שיער חוליות מבוגר. פרוטוקול זה מדגים את לנתיחה קנס של האפיטל, שבאמצעותו אנו יכולים לקבל דגימות רקמה לחקר אירועי משובי ברמות הסלולר subcellular.

תקציר

נוירו epithelia באוזן הפנימית הם מבנים חיוני פונקציות השמיעה ושיווי המשקל. לכן, חשוב להבין את התכונות תאית ומולקולרית של האפיטל, אשר מורכב בעיקר שני סוגים של תאים: תאים שיער (HCS) ותאים תומכים (SCS). כאן אנו בוחרים ללמוד את epithelia האוזן הפנימית חושית דג הזברה מבוגר לא רק בגלל המבנים אפיתל הם שמור ביותר בכל חוליות למד, אלא גם משום דג הזברה מבוגר הוא מסוגל להתחדש HCS, יכולת כי היונקים לאבד זמן קצר לאחר הלידה. אנו משתמשים האוזן הפנימית של דג הזברה בוגר כמודל למערכת ללמוד את מנגנוני התחדשות פנימית HC אוזניים אצל בעלי החוליות מבוגר שיכול להיות מועיל עבור הטיפול הקליני של שמיעה / איזון גירעונות האדם כתוצאה של אובדן HC.

כאן אנו מדגימים איך לעשות והניתוחים הגולמי קנס של epithelia האוזן הפנימית חושית דג הזברה מבוגר. דיסקציה ברוטו מסיר את הרקמות הסובבות את האוזן הפנימית מועיל להכנת סעיפים רקמות, אשר מאפשר לנו לבחון את המבנה המפורט של epithelia החושי. דיסקציה בסדר שמנקה את אי - חושית, רקמות אפיתל של האפיתל בנפרד ומאפשר לנו לבחון את ההטרוגניות של האפיתל כל בקלות כל הר דגימות אפיתל.

פרוטוקול

חלק 1: הכנת הרקמה

1. להרדים את דג הזברה מבוגר עם שנאגרו MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate מלח methanesulfonate, 0.03%).
2. לערוף את הדגים. חותכים את הלסת התחתונה, במקום הראש על כרית דיסקציה עם הצד הגחוני למעלה, לשתק את הרקמה עם סיכות חרקים. הסר את רקמות רכות הגחוני אל הגולגולת לפצח את החלק הגחוני של הקפסולה את הגולגולת עם פינצטה קנס תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
3. תקן ראש דג paraformaldehyde (4%) ב -4 ° C במשך הלילה.
4. שטפו את ראש הדג קבוע PBS (פוספט בופר, 1X) במשך 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.

חלק 2: דיסקציה הגולמי של האוזן הפנימית

1. מניחים את הראש על כרית דגים לנתיחה עם למעלה בצד הגחון. לשתק אותו עם סיכות חרקים. כל הצעדים הבאים מתבצעים תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
2. עם פינצטה בסדר, להסיר את עצם הגולגולת מעל האוזן הפנימית ואז בזהירות לשלוף את רקמות האוזן הפנימית: saccules, lagenae ו utricles. שקיק ו lagena הם בחוזקה לצרף אחד את השני ובכך להוציא ביחד בעוד utricle (anterior את שקיק ו lagena), סביר מאוד להיות מנותקת מן האיברים הקצה השני במהלך לנתיחה.
3. שים את רקמות האוזן הפנימית של PBS (1X). אם לא לנתיחה קנס נוסף נדרש, יש לשטוף את הרקמה 2-3 פעמים עם PBS (1X) והוא יכול לשמש בניסויים אחרים, למשל cryosections.

חלק 3: דיסקציה פיין epithelia של האוזן הפנימית החושית

1. דיסקציה הקנס יכול להתבצע ירידה של PBS (1X) בשקופית זכוכית נקי.
2. הסר את אבן האוזן utricular מ utricle עם שני זוגות של פינצטה בסדר, ואם תרצה, לקצץ את רקמת האפיתל ללא חושית ועל עצבוב מן epithelia עם פינצטה בסדר להב מחט.
3. הסר את אבן האוזן lagenar לפני הפרדת saccular ו lagenar epithelia בעוד מנסה לשמור על שקיק כולו שלם ככל האפשר. מניחים את הרקמה הירידה PBS עם למעלה בצד הגחון. השתמש בלהב המחט בזהירות לחתוך בין שקיק ו lagena. חתוך את הרקמה מופרז שאינו חושי אפיתל innvervation עם פינצטה בסדר הלהב מחט, אם תרצה בכך.

חלק 4: מכתים פלורסנט של תאים שיער epithelia חושית

1. שוטפים את חושי epithelia עם PBT (1XPBS ואת טריטון 1% X-100) במשך 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.
2. דגירה epithelia עם fluophore שכותרתו phalloidin (למשל אלקסה 488 Phalloidin קמח, 1:1,000 דילול) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. שוטפים את חושי epithelia עם PBT במשך 3 פעמים, 10 דקות בכל פעם.
4. הר epithelia לשקופית עם הרכבה בינונית לבדוק את הרקמה תחת המיקרוסקופ מוכתם ניאון עם מסננים של הגל הנכון.
5. לאחר דיסקציה מכתים מוצלח, epithelia שלם עם תא חזקה מכתים שיער צרור ניתן לראות תחת מיקרוסקופ (איור 1).

באיור 1. תאים שיער של האפיתל חושית saccular הוכתמו אלקסה 488 קמח Phalloidin (ירוק). דגימת הרקמה היה גזור ומוכתמת כאמור בעיתון. מספר תמונות צולמו בתנוחות שונות המדגם רעפים יחד עם Adobe Photoshop 7.0.
בר סולם = 150μm.

דיון

בפרוטוקול זה, אנו תיאר את לנתיחה הגולמי קנס של epithelia האוזן הפנימית החושית של דג הזברה למבוגרים, אשר מאפשר לנו להכין דגימה לחקר תכונות הסלולר subcellular של epithelia החושי.

על מנת לבצע דיסקציה מוצלח, הצעד הראשון מאוד, קיבעון, הוא מאוד חשוב. ודא כי אתה תמיד להשתמש בפתרון paraformaldehyde מוכן טרי כי הפתרון הישן תגרום קיבעון תחת של רקמות שקשה לטפל במהלך הניתוח. עם זאת, ודא כי אתה לא מעל לתקן את הרקמות על ידי הש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	ריאגנט	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	ריאגנט	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyde	ריאגנט	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	ריאגנט	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	ריאגנט	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	ריאגנט	Vector Laboratories	H-1500
מיקרוסקופ דיסקציה	מיקרוסקופ	Nikon Instruments	SMZ1000
סיכות לחרקים	כלי	Fine Science Tools	26000-40
מספריים	כלי	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
פינצטה	כלי	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
להב מחט	כלי	Sharpoint	78-6810
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	מיקרוסקופ	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
משטח לדיסקציה	כלי	eNasco	SB07840M
Zebrafish	בעל חיים	שונים	n/a