בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal
במאמר זה
סיכום
תקציר
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה במעבדה שלנו פיתחה לנתח את צורת התא שינויים rearrangements נדרש לכופף ולקפל את המוח דג הזברה מתפתח (Gutzman et al, 2008). ניתוח כזה מאפשר הבנה חדשה של ביולוגיה של התא הבסיסי הדרוש לפיתוח של מבנה 3D של המוח החוליות, מגביר באופן משמעותי את היכולת שלנו ללמוד המורפוגנזה בצינור העצבי. המוח העוברי היא בצורת דג הזברה החל הפריה 18 שעות שלאחר (hpf) כמו החדרים בתוך neuroepithelium לנפח. עד hpf 24, השלבים הראשונים של המורפוגנזה בצינור העצבי הושלמו. באמצעות השיטה המתוארת כאן, עוברים בשלב מסוים התא מוזרקים עם קידוד mRNA קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (memGFP). לאחר hpf הזרקת הדגירה, העובר, בין 18 ל 24 עכשיו, הוא רכוב, הפוך, ב agarose הדמיה על ידי מיקרוסקופיה confocal. יש לציין כי העובר דג הזברה שקוף שהופך אותו אידיאלי עבור מערכת דימות פלואורסצנטי. בעוד ניתוחים שלנו התמקדו גבול למוח האחורי, המוח התיכון לבין למוח האחורי, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב לניתוח האזור כל דג הזברה עד לעומק של 8-10 מיקרומטר.
פרוטוקול
1. הכנת ה-mRNA עבור הזרקה
- MRNA השתמשו בהליך זה הוא עיבד מ קידוד פלסמיד CAAX-eGFP (memGFP) mRNA. ראשית linearize פלסמיד לפי Gutzman et al, 2008.
- ואז לתמלל mRNA memGFP באמצעות mMachine mMessage ערכת.
- לדלל את ה-mRNA שנוצר 1μg/μl, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C.
- הכן עובש הזרקת agarose של 1% עם נתיבים ברוחב של עוברים בשלב אחד את התא.
- יום לפני ההזרקה, להקים כלובי ההזדווגות הפרדת הזכר מן הנקבות.
- ביום של הזריקה, למשוך מחטים נימי באמצעות חולץ micropipette להתכונן ההזרקה.
2. הזרקת ה-mRNA
- ביום של הזריקה, להפשיר aliquot של mRNA memGFP 1μg/μl על הקרח.
- לדלל את ה-mRNA 01:05 במים לריכוז סופי של 200ng/μl, ולשמור על הקרח.
- טען את המחט נימי עם 1μl של mRNA memGFP מוכן ב 200ng/μl.
- מקום טעון מחט לתוך micromanipulator מצורף בנזין microinjector.
- התאם את עוצמת הזריקה כדי 1nl.
- משוך את חוצצים על דגים סוג בר להגדיר בכלובים זיווג מן היום הקודם.
- אסוף את העוברים ברגע שהם הניחו. אוריינט אותם עובש הזרקת agarose מכוסה על ידי בינוני העובר (Westerfield, 1995) עם תא בודד בצד הרחק micromanipulator.
- הזרק דרך סיסית ו חלמון כזה mRNA מופקד ישירות לתא בודד. להזריק כ 50 עוברים לכל ניסוי. אין להזריק אם התא חילק.
- עוברים דגירה על 28 ° C במשך הלילה בינוני העובר
3. הרכבה ועוברים הדמיה
- כדי לטעון את התמונה עוברי, להסיר את סיסית עם מלקחיים מן העוברים תחת stereomicroscope שעה אחת לפני נקודת הזמן של עניין.
- הכינו שקופית עבור הרכבה עד 4 עוברים.
- השתמש ואקום גריז סיליקון לאטום coverslip על החלק התחתון של שקופית 2 מ"מ בעובי במיוחד פלסטיק עם חור בקוטר של כ 1cm.
- ממלאים את החור שקופית עם agarose 0.7%, ולתת לעמוד כ -20 דקות או עד מוקשה
- לאחר agarose יש הקרושה, להסיר תוסף קטן בעזרת פיפטה 200μl טיפים ליצירת חורים גליליים שבו לעלות כל העובר.
- מניחים את העוברים בשקופית agarose המלא תחת מיקרוסקופ לנתח. הוסף 50μl של tricaine (Westerfield, 1995) כדי להרדים את העוברים.
- שימוש במלקחיים לתפקיד עוברים את החורים גלילי ב agarose עם המוח או באזור של עניין נגד coverslip הבסיסית.
- מכסים את העוברים על agarose עם coverslip נוסף מאובטח עם גריז סיליקון ואקום.
- תמונה העובר באמצעות הפוכה, פלורסנט, לייזר או סריקת דיסק ספינינג מיקרוסקופ confocal. תמונה ב 63x או יותר לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך neuroepithelium.
- תמונות מיוצאים כקובצי TIFF מתוך התוכנה LSM ונותחו באמצעות Photoshop.
4. תוצאות נציג / תוצאה
שמוצג באיור 1 היא תמונה confocal נציג neuroepithelium hpf 24 דג הזברה בין המוח התיכון, ואל החדרים למוח האחורי. כל תא מסומן עם GFP קרום הנכנס.
באיור 1. חיים הדמיה confocal של העובר memGFP-מוזרק hpf 24 דג הזברה.
(א) Neuroepithelium של עובר 24 hpf עם כל תא שהותוו על ידי ה-GFP. אזור צילמו מפריד בין המוח התיכון ואת החדרים למוח האחורי (ז, ח, בהתאמה), ויצרו את הגבול המוח התיכון, למוח האחורי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה הזרקת mRNA עוברי דג הזברה לתוך תא בודד. כאן, אנו משתמשים mRNA קידוד GFP קרום במיקוד לתייג כל תא. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד הר התמונה במוח המתפתח ברזולוציה של תא בודד. טכניקה זו אפשרה לנו ללמוד סוג חדש של שינוי צורת התא, ההתכווצות הבזליים, נדרש היווצרות גבול למוח האחורי, המוח התיכון (Gutzman et al, 2008). ניתוח דומה של תופעות אחרות יש פוטנציאל להרחיב באופן משמעותי את הבנתנו המורפוגנזה החולייתנים לבין ביולוגיה של התא הבסיסי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
תודה רבה ד"ר ג'ניפר Gutzman מי הראשון שפותח את הטכניקה הזו במעבדה אלימה. תודה גם JB גרין בבית דנה פרבר סרטן המכון בבוסטון, מסצ'וסטס, אשר חביב סיפק את הקידוד פלסמיד CAAX-GFP-mRNA. הדמיה confocal נערך במתקן קק WM ביולוגית הדמיה הקרן ב וייטהד. HS נתמכת על ידי NIHMH70926. EG הוא נתמך על ידי מענק NSF מראש דוקטורט.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | ריאגנט | Lonza Inc. | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| צינור נימי | כלי | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| גריז סיליקון לוואקום | ריאגנט | VWR international | W0S717 | |
| פינצטה | כלי | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| טיפים לפיפטה 1-200 μl | כלי | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | אלו הם הגדלים המתאימים לעוברים בני 24 hpf. |
| ערכת שעתוק mMessage mMachine | ריאגנט | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| מיקרוסקופ קונפוקלי סורק Zeiss LSM 510 | מיקרוסקופ | Carl Zeiss, Inc. | ||
| מיקרומניפולטור | כלי | Narishige International | ||
| מיקרואינז'קטור | כלי | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| מכשיר למשיכת מיקרופיפטות | כלי | Sutter Instrument Co. |
מקורות
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
