אנו מדגימים את השימוש extensometer כוח קבוע, למדוד לטווח ארוך הארכה (זחילה) של תא הדגימות צמח קיר המושרה על ידי מאגרים חומציים חלבון expansin.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת תא הצמח החומה הרחבה (Creep) מושרה על ידי ה-pH חומצי על ידי Alpha-Expansin
במאמר זה
סיכום
תקציר
גידול הצמח קירות התא אופיינית התערוכה מאפיין בשם "צמיחה חומצה", שבו אנו מתכוונים הם הרחבה יותר ב-pH נמוך (<5) 1. האוקסין הורמון מגרה צמח במהירות התארכות התא נובעת צעירים ורקמות דומה לפחות חלקית על ידי מנגנון חומצה צמיחה 2, 3. אוקסין מפעיל משאבת H + בקרום פלזמה, גרימת החמצה של הפתרון דופן התא. החמצה הכותל מפעיל expansins, אשר אנדוגני קיר התרופפות התא חלבונים 4, בגרימת דופן התא להיכנע המתחים קיר שנוצר על ידי לחץ turgor התא. כתוצאה מכך, התא מתחיל להגדיל במהירות. תופעה זו "צמיחה חומצה" נמדדת בקלות מבודדים (הדומם) דגימות דופן התא. היכולת של קירות התא לעבור חומצה הנגרמת הארכה אינה רק תוצאה של הסדר המבני של קיר סוכרים תא (פקטינים למשל), אבל תלוי בפעילות של expansins 5. Expansins אין שום הפעילות האנזימטית ידוע שהדרך היחידה assay לפעילות expansin היא למדוד גיוסם של הרחבה דופן התא. דו"ח זה מפרט את מקורות וידאו וטכניקות הכנה לקבלת חומרים קיר מתאים מבחני expansin וממשיך להראות חומצה הנגרמת הארכה expansin-Induced הרחבה של דגימות קיר שהוכן hypocotyls מלפפון גדל.
כדי להשיג מתאים הקיר דגימות תאים, שתילי מלפפונים גדלים בחושך, hypocotyls נחתכים קפואים ב -80 ° C. Hypocotyls קפואים הם משופשפות, שטוח, והידק אז המתח המתמיד קובט מיוחד עבור מדידות extensometer. כדי למדוד חומצה הנגרמת הרחבה, הקירות שנאגרו בתחילה ב-pH נייטרלי, וכתוצאה מכך פעילות נמוכה של expansins כי הם מרכיבי דופן התא הילידים. עם חילופי חיץ pH חומצי, expansins מופעלים ואת קירות התא להרחיב במהירות. אנחנו גם מדגימים פעילות expansin ב assay הכינון מחדש. עבור חלק זה, אנו משתמשים טיפול בחום קצר לפגל expansins יליד בדגימות דופן התא. אלה קירות התא מומת לא להאריך גם חיץ חומציים, אך תוספת של expansins את קירות התא במהירות משחזר את יכולתם להאריך.
פרוטוקול
חלק 1: גידול ואחסון חומר צמחי מתאים
- מניסיוננו, hypocotyls צעירים שתילי מלפפון מולבן לשמש מקור נוח של החומר דופן התא עבור ניסויים אלו. זרעי מלפפון נזרעים על נייר רטוב בתיבה אור הוכחה, שהוא לשמור בארון חשוך בחדר טמפרטורה קבועה נקבע על 26 ° C. הטמפרטורה המדויקת אינה קריטית, כמו כל דבר בין 22 ° לבין 30 ° C אמור להיות בסדר, אבל הטמפרטורה תקבע כמה מהר השתילים מגיעים בשלב המתאים של התפתחות. חם הטמפרטורה, מהר יותר שתילים יפתחו. אנו משתמשים בדרך כלל השתילים כשהם גדלו על 5 ס"מ אורך, אשר הגיעו 3-4 ימים לאחר הזריעה. חשוב כי שתיל להיות מבוגר בחושך, כמ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
להדגמה זו השתמשנו קירות התא מן hypocotyls מלפפון כי הם הוכיחו להיות מקור אמין של דגימות הקיר כי הם קל לטפל כי להגיב ברגישות טוב. יש לנו גם הצלחה טובים עם קירות שתילים אחרים, כמו גם כמה חומרים מהסופרמרקט, כמו עלי תרד צעירים גבעולי סלרי. בעיקרון, צעיר, רך, רקמות הצמח גדל במהירות צפויות להימדד בקלות עם טכניקה זו, אבל קשוח, זקן, רקמות הצמח מחומצן או nongrowing צפויים להיות קשוב בגלל תא הקיר לחצות קישור. ישנם עוד כמה דברים להיזהר:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
טכניקות המוצגים כאן פותחו במימון על ידי מענקים ממשרד האנרגיה (מדעי Bioenergy) ואת הקרן הלאומית למדע.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מקורות
- Cosgrove, D. J. Characterization of long-term extension of isolated cell walls from growing cucumber hypocotyls. Planta. 177, 121-130 (1989).
- Rayle, D. L., Cleland, R. E. The Acid Growth Theory of auxin-induced cell elongation is alive and well. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
