אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
שיטה זו משמשת כדי לחלץ DNA גנומי מולקולרי גבוה משקל מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex כי טופלו למאגר אחסון / תמוגה לארכיון ב -80 ° C, כדי לטהר את ה-DNA באמצעות שיפוע צפיפות צזיום כלוריד. פרוטוקול מתחיל עם שני שעה צעדים הדגירה לשחרר את ה-DNA מתאי ולהסיר RNA. בשלב הבא, בסדרה של פנול: כלורופורם ו כלורופורם עקירות מבוצעות ואחריו צנטריפוגה להסיר חלבונים בממברנה מרכיבי התא, אוסף של תמצית ה-DNA מימית, וכמה חילופי חיץ צעדים כדי לרחוץ לרכז את תמצית. חלק חמישי מתאר את טיהור אופציונלי באמצעות שיפוע צזיום כלוריד צפיפות. מומלץ לעבוד עם פחות מ 15 דגימות בעת ובעונה אחת, כדי למנוע בלבול ולכרות זמן פרוטוקול. סך כל הזמן הנדרש פרוטוקול זה תלוי במספר דגימות להיעקר. במשך 10-15 דגימות בהנחה צנטריפוגה ציוד מתאים זמין, בפרוטוקול זה כולה צריכה לקחת 3 ימים. ודא שיש לך את התנורים הכלאה מוגדר הטמפרטורה בתחילת התהליך.
פרוטוקול
הערה: כל ריאגנטים להשתמש בפרוטוקול זה aliquoted ממניות מעבדה לתוך קטן יותר במניות, עובד זה מאוד חשוב כדי למנוע זיהום לחצות של דגימות DNA שלך וזיהום של מניות מעבדה. כמו כן, כאשר pipetting, הקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות.
חלק ראשון: תמוגה תא עיכול
- בגין בפרוטוקול זה על ידי הפשרת מסננים Sterivex המכילים ביומסה planktonic מרוכז בעבר על הקרח. לשם הפשטות, כאן אנו מתארים את הליך עיבוד מסנן הפרט. בפועל, אנו ממליצים עיבוד 16 או מסננים פחות בכל פעם.
- לאחר הסינון יש להפשיר, להתחיל את הראשון מבין שני incubations: אחד lyse התאים ולהסיר RNA, ואחד לשבור חלבונים. במשך הדגירה הראשונה, להוסיף 100 ליזוזים μl (125 מ"ג בשנת 1000 TE μl) ו 20 מ"ל RNase (10 מיקרוגרם / מ"ל) לסינון. Reseal את המסנן עם Parafilm ולהשאיר אותה לסובב בתנור הכלאה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- במשך הדגירה הבאה, להוסיף 100 K proteinase μl 100 SDS ו 20% μl לסינון. Reseal באמצעות Parafilm ולהשאיר אותה לסובב 1-2 שעות בתנור הכלאה, הפעם על 55 ° C.
- באמצעות מזרק 5cc, העברת lysate מן לסנן Sterivex לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. יש לשטוף את המסנן עם חיץ 1 תמוגה מ"ל ולהוסיף את נוזל lysate לשטוף בצינור שלך פלקון באמצעות מזרק 5cc. עכשיו שיש לך lysed ו מתעכל התאים שלך, אתה מוכן לחלץ DNA שלהם.
חלק שני: הפקת DNA
- השלב הבא הוא להשתמש בשיטת פנול, כלורופורם כדי לחלץ את ה-DNA מן lysate שלך. הוסף נפח שווה (כ 3ml) של פנול: כלורופורם: אלכוהול Isoamyl (רש"ת) על הצינור lysate, והקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. וורטקס למשך 10 שניות כדי ומערבבים היטב.
- ספין התחתית גרם 2500 במשך 5 דקות, כדי לוודא צנטריפוגה היא מאוזנת. במהלך צנטריפוגה, את התערובת פנול, כלורופורם, lysate צריך להפריד לשתי שכבות: שכבה אורגנית המכילה את כלורופורם פנול, וחלבונים מן המדגם שלך, על הקרקעית, שכבה מימית, אשר מורכב של הדנ"א שלכם, מים אחרים מולקולות הידרופיליות יותר, על העליונה.
- מעבירים את השכבה המימית (המכילים DNA שלך) לתוך צינור חדש פלקון 15 מ"ל. היזהר שלא לגעת בממשק עם קצה הפיפטה (תמיד להשאיר כמות קטנה של השכבה המימית מאחור).
- כדי צינור חדש זה, להוסיף נפח שווה (כ 3mL) של כלורופורם: רשות העתיקות, והקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. וורטקס למשך 10 שניות. פעולה זו מסייעת להסיר כל פנול שנותרו דגימת DNA שלך.
- ספין על 2500 גרם במשך 5 דקות או עד שכבה מימית ברור. העברת שכבה מימית לתוך צינור חדש, Falcon שכותרתו ולהוסיף 1 מ"ל של TE ב-pH 8.0, נזהר שלא לגעת בממשק עם קצה הפיפטה (תמיד להשאיר כמות קטנה של השכבה המימית מאחור). זו שכבה מימית המכילה תמצית ה-DNA שלך.
חלק שלישי: ריכוז דנ"א כביסה
- השלב הבא הוא לשטוף ולרכז את דגימת DNA בתוך שפופרת 15 מ"ל Amicon צנטריפוגות אולטרה. צינורות Amicon מורכב מסנן אשר שומרים על מולקולות או מעל משקל מולקולארי שצוין (retentate) ו צינור לתפוס את flow-through (תסנין). במקרה זה, מסנן שומר ה-DNA שלך (retentate). העברת תמצית ה-DNA שלך צעד 2.5 לתא מסנן צינור Amicon Ultra.
- ספין על 3500 גרם במשך 10 דקות. ודא שיש פחות מ 1 מ"ל של נוזל שמר במסנן Amicon. אם נשאר יותר retentate, למלא את המסנן עם TE ספין שוב. הקפד להשתמש טיפ פיפטה טרי בנוסף כל TE כדי למנוע זיהום לחצות.
- הסר את הזרימה דרך, או תסנין, אל צינור אחר פלקון ולשמור אותו במקרר עד שתאשר המוצר הסופי שלך על ה-DNA ג'ל (חלק רביעי).
- הוסף חוצץ 2 מ"ל TE את מסנן Amicon ספין על 3500 גרם במשך 6 דקות, כדי לוודא להשתמש קצה פיפטה טריים עבור כל TE בנוסף, כדי למנוע זיהום לחצות. בריכת תסנין עם זה משלב 3.3 ולשמור במקרר.
- לשטוף את ה-DNA עוד פעמיים עם TE עבור סכום כולל של שלושה שוטף (מוודא תמיד להשתמש טיפ פיפטה טרי), ושמירת תסנין בכל פעם (כמו צעדים לכל 3.3 ו -3.4). בשביל לשטוף האחרון, ספין מ"ל עד 200-500 של שרידים retentate במסנן Amicon. הקלט את נפח סופי ולהעביר את retentate (המכילים DNA שלך) כדי צינור שכותרתו Eppendorf 1.5 מ"ל.
חלק רביעי: קביעת איכות DNA
- בדוק את איכות דנ"א להעריך את ריכוז ה-DNA על ידי ואוזל דגימות שלך על 0.8% ג'ל agarose ג'ל staעומד לבחינה עם 1ml ethidium ברומיד (EtBr) לילה. (היה זהיר מאוד בעת שימוש EtBr-זהו mutagen ידוע כמסרטן חשוד. הקפד להחליף כפפות לעתים קרובות למנוע העברת EtBr לשאר במעבדה על העור שלך.) טען את דגימות ה-DNA ליד סולמות, המהווים גודל ועוצמת סטנדרטים (ראה שלב הבא).
- בסמטאות מספר הראשון, עומס סולמות עם להקות של משקולות מולקולרית בריכוזים שונים. אנו ממליצים על דפוס הטעינה הבאה: בסמטאות הראשונה והאחרונה (נתיבי החיצונית), עומס 10 μl של 50ng/μl של 1kb + או סולם 2log. ב נתיבים 2,3 ו - 4, 2 μl לטעון, μl 5 ו -10 μl, בהתאמה, הסולם λHindIII 50ng/μl. לבסוף, עומס 5 μl לכל נתיב של תמצית ה-DNA עם צבע עבור כל דגימה.
- הרץ את הג'ל על 15 וולט למשך כ 16 שעות (מומלץ לרוץ בין לילה).
- למחרת, לצלם את הג'ל באמצעות מערכת UV תיעוד ג'ל. כדי לקבוע את טווח המשקל המולקולרי של הדנ"א שלכם הריכוז שלה, השווה את להקות להקות מדגם של הסולמות. DNA באיכות טובה יהיה משקל מולקולרי גבוה (> 36kb), ולהראות מעט עדויות של גז / השפלה. ראה איור 1.
פרק חמישי: צנטריפוגה צזיום כלוריד Gradient
- אם איכות ה-DNA הוא טוב כמות מספיקה, אתה יכול להמשיך לטהר את ה-DNA על ידי ביצוע צזיום כלוריד (CsCl) צנטריפוגה הדרגתי. שים לב, שלב זה הוא אופציונלי טיהור אינו הכרחי עבור כל היישומים במורד הזרם (לדוגמה, אם אתה רוצה ליצור ספריות fosmid אתה צריך לטהר, ואילו אם אתה פשוט רוצה לבצע ריאקציות PCR, טיהור אין צורך בדרך כלל). ראשית, התווית שפופרת אחת עבור צנטריפוגות מדגם זה.
- כדי צינור כל צנטריפוגה, להוסיף 160 מ"ג CsCl, 178 μl של הדנ"א הגנומי. לאחר הוספת CsCl ו-DNA אל הצינור, מקום פיסה קטנה של parafilm על גבי הצינור בעדינות להפוך את צינור 1-20 פעמים על מנת לערבב את המרכיבים. אל תערבב ידי pipetting, אשר עלול לגרום הגז של ה-DNA. לאחר מכן, הוסף 10 μl של 10 מיקרוגרם / EtBr μl אל הצינור הזה לערבב אותו באותה דרך. (היה זהיר מאוד בעת שימוש EtBr-זהו mutagen ידוע כמסרטן חשוד. הקפד להחליף כפפות לעתים קרובות למנוע העברת EtBr לשאר במעבדה על העור שלך.)
- ודא כי המשקל של כל הצינורות מאוזנים לפני צנטריפוגה כזה כי ההבדלים במשקל בין הצינורות הם פחות מ 1 מ"ג.
- מניחים את צינורות hemostat באמצעות הרוטור, לסגור את המכסה ומניחים את הרוטור בתוך ultracentrifuge.
- סגור את הדלת ultracentrifuge. אבק תחול ברגע שאתה סוגר את הדלת. הפעל לילה בסל"ד 100,000 עבור 18 שעות ו 20 ° C.
- כאשר צנטריפוגה היא מוחלטת, להוציא את הצינורות מן הרוטור באמצעות hemostat מקום על מדף צינור.
- דמיינו את ה-DNA transilluminator עם אור כחול, או אם זמין, להשתמש באור UV אורך גל ארוך, בחדר חשוך. לבשי זוג משקפיים ענבר מסנן כדי לראות את להקת ה-DNA. ראה תרשים 2.
- באמצעות מזרק 1cc מחט סטרילית (26G 5 / 8), להסיר את הלהקה DNA ולמקם אותו צינור Eppendorf 1.5ml.
- כדי לעזור לשחזר את רוב הדנ"א לכוד בתוך החלל מת המזרק, לשטוף את המזרק עם TE 100 μl ולהוסיף הפתרון שטפה את הצינור. הכן קנה אחד עם חיץ TE 100 μl לפי המדגם, כדי למנוע זיהום לחצות.
- כדי להסיר EtBr מ-DNA, מוסיפים נפח שווה של מים רוויים butanol אל הצינור, להפוך את צינורות בעדינות 10-20 פעמים, צנטריפוגה בסל"ד 10000 דקה 1 ולסלק את השכבה העליונה.
- חזור כביסה עד לצבע שקוף butanol, 3 - 4 פעמים יותר.
- מקום 4 מ"ל TE בצינור Amicon אולטרה צנטריפוגה ולהוסיף את פתרון ה-DNA מלמעלה.
- צנטריפוגה ב g 3500 בטמפרטורת החדר, עד נפח DNA מצטמצם μl כ 100-500 (בערך 6-7 דקות) וזורקים את הזרימה דרך.
- הוסף 2ml TE כדי Amicon לסנן צנטריפוגות ב 3500 גרם במשך 6 דקות, כדי לוודא להשתמש קצה פיפטה טרי בנוסף לכל, כדי למנוע זיהום לחצות. חזור פעמיים.
- תתרכז לנפח סופי של μl 50-100 על ידי צנטריפוגה נוספות במידת הצורך, ולהעביר את פתרון ה-DNA על מנת לסנן את צינור חדש Eppendorf 1.5 מ"ל.
- הוסף 40 μl TE את מסנן Amicon ו פיפטה למעלה ולמטה לאורך שני הקרומים לסנן לשטוף את כל הדנ"א הנותרים. הוספת פתרון זה הצינור ב 5.15.
- מניחים YM-30 Microcon יחידת המסנן לתוך צינור Microcon ו prewash Microcon ידי הוספת מים autoclaved 200 μl ו centrifuging בסל"ד 10000 במשך 7 דקות.
- מוסיפים את פתרון ה-DNA מ 5.16 ל Microcon prewashed מנת להמשיך לרכז את ה-DNA. צנטריפוגה ב g 5000-10000 עבור 1-3 דקות. בדוק את כמות הנוזלעל צנטריפוגה מסנן וחזור עד לסכום של נוזל על המסנן מצטמצם μl כ 50.
- הנח את יחידת המסנן הפוך בצינור Microcon חדשים צנטריפוגות ב 1000 גרם במשך 3 דקות. הכמות האידיאלית של פתרון מרוכז הוא 50-60 μl.
- מדוד ורשום את ריכוז ה-DNA על Nanodrop ולבדוק את איכות שיא (יש 260nm).
- העברת aliquot קטן של ה-DNA לצינור Eppendorf נקי לעבודה מניות להקפיא בטמפרטורה של מינוס 20. מעבירים את שאר ה-DNA כדי לנקות שנייה Eppendorf להקפיא בטמפרטורה של מינוס 80.
נציג תוצאות:
כאשר פרוטוקול זה הוא נעשה בצורה נכונה, אתה אמור לראות תמונה ג'ל אחרי צעד 4.4 בקביעת איכות DNA דומה באיור 1. ריכוז ה-DNA של תמציות בפועל ישתנו בהתאם למקור של המדגם. לאחר שלב 5.7 ב צנטריפוגה שיפוע CsCl, הדנ"א הגנומי מואר באור כחול צריך להיראות דומה איור 2.
באיור 1. 0.8% agarose תמונה ג'ל אלקטרופורזה של דנ"א משקל מולקולרי גבוה שנאספו מארבע במעמקי ב subarctic האוקיינוס השקט (בשני עותקים), מוכתם הסוכן intercalating ethidium ברומיד (10 מ"ג / מ"ל). הג'ל היה לרוץ 15V עבור ~ 16hrs במאגר TBE 1X הג'ל פועל. להקות לדוגמה הם באיכות טובה מראה מעט עדויות של הגז מכני (מראה להקות בודדות או מריחות בניגוד להקות מרובות) למרות תמציות 10m לשמור RNA כמה לשאת מעל (ראה למרוח בטווח Kb 0.5-2.0).
איור 2. הלהקה הדנ"א הגנומי מואר באור כחול לאחר צנטריפוגה שיפוע CsCl.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תלוי כמה דוגמאות רבות להיות מעובד, זה יכול להיות הליך הזמן אינטנסיבית בשל שני צעדים הדגירה של שעה אחת, ואת שוטף חוזרות צעדים צנטריפוגה. עדיף לתכנן יומיים שלמים לצורך הליך זה להשאיר הרבה זמן. אם יש בעיות מקבל את נפח לחלץ הסופי בצינור Amicon להפחית עד 200 500μl במהלך ריכוז דנ"א כביסה, לנסות עושה נוספים שוטף TE ו centrifugations (לחזור על חלק שלישי) עד נפח המתאימה שאריות. כמו כן, אם לחלץ את ריחות חריפה של כלורופורם, עדיף לעשות שוטף נוסף עד הריח מפחית כדי לוודא את כל כלורופורם הו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס הפתוח. JJW נתמכה על ידי מלגות של NSERC ו דאו נתמכה על ידי מלגות של NSERC, Killam ויסוד טולה מרכז מימנה עבור גיוון התפתחות חיידקים. SL נתמכה על ידי המרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 1 סמ"ק (מחט 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| מזרק 1 מ"ל (מחט 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| מבחנות Eppendorf בנפח 1.5 מ"ל | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| מבחנות 15 מ"ל | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| מזרק 5 סמ"ק | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® מכשירי סינון צנטריפוגליים Ultra-4 | EMD Millipore | UFC801096 | גבול משקל מולקולרי נומינלי של 10,000 |
| בוטנול | Fisher Scientific | A383-1 | הפכו אותו לרווי במים (בוטנול:מים = 1:1) |
| רוטור צנטריפוגה, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| צנטריפוגה, Avanti® דלקת מוח ויזונה יפנית | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| צזיום כלוריד | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| כלורופורם:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| אתידיום ברומיד (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| אתילנדיאמיןטטרהחומצה אצטית, מלח הדיסודיום, דיהידרט | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| תנור היברידיזציה | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| בופר ליזיס | סוכרוז 0.75 M, EDTA בריכוז 40 mM, Tris בריכוז 50 mM (pH 8.3) | ||
| ליזוזים | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 מ"ג ב-1000 μl TE |
| Microcon® יחידת סינון צנטריפוגלית Ultracel YM-30 | EMD Millipore | 42410 | סף של 50 bp |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| פנול:כלורופורם:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| פרוטאינאז K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μג'/מ"ל |
| מכשיר דימות בטוח™ טרנס-אילומינטור לאור כחול | Invitrogen | S37102 | |
| סודיום דודציל סולפט (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| מסנני Sterivex | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| סוכרוז | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| צנטריפוגה שולחנית | Eppendorf | 5415D | |
| בופר TE, pH 8.0 | |||
| Trizma® בסיס | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| רוטור לאולטרסנטריפוגה, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| מבחנת אולטרסנטריפוגה (7X20 מ"מ, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| מתקן מבחנות לצנטריפוגה אולטרה (Ultracentrifuge) | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| אולטרה-צנטריפוגה, Optima® מקס | Beckman Coulter Inc. |
מקורות
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
