Method Article

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרוב המכריע של חיידקים בטבע כיום להישאר נגיש שיטות הטיפוח המסורתיות. במהלך העשור האחרון, תרבות עצמאית גנומית סביבתיים (

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנייה Fosmid ספריה כבר מחולק לארבעה שלבים עיקריים ותת מחולק למספר חלקים (ראו תמונה 1 עבור סקירה).

שלב אני (ראה פרוטוקול "מיצוי דנ"א 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex" [3])

חלק 1: אנזימים catalyzed תמוגה התא

חלק 2: טיהור של ה-DNA סביבתי על ידי צנטריפוגה שיפוע CsCl צפיפות והתאוששות DNA

חלק 3: בקרת איכות של ה-DNA שחולצו על ידי ג'ל אלקטרופורזה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך מתואר כיצד היעיל ביותר ליצור ספרייה גדולה הכנס fosmid עם הדנ"א הגנומי נגזר מדגם מים החוף. Up-stream-DNA הגנומי מיצוי מתואר בפרוטוקול נפרד [3].

כפי הייצור fosmid-ספריית הוא רב שלבי תהליך, תוכנית לפחות שבועיים עד שלושה שבועות בזמן ההליך כולו, כולל כל הצעדים שהוצגו ארבע. החילוץ של הדנ"א הגנומי הוא הצעד החשוב ביותר וכל זרם למטה הצעדים מסתמכים על איכות וכמות של הדנ"א הגנומי חילוץ; כך לשקול מבלה מס.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס ​​הפתוח. MT ו - SL נתמכו על ידי מלגות ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים (CMDE). MT גם קיבל מלגת תמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שלב II
CopyControl™ ערכת ייצור ספריית Fosmid EpicentreBiotechnologiesCCFOS110 מספיק כדי ליצור 9-10 ספריות fosmid
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
פלטה חמה מערבבתCorningPC-420D
1.0X TAE מאגר
CHEF Mapper XA מערכת אלקטרופורזה בשדה פועם כולל מודול קירור ומשאבהבמהירות משתנהBio-Rad
λ DNA-HindIII Digestניו אינגלנד BiolabsN3012S
טווח בינוני I סמן PFGניו אינגלנד BiolabsN3551S
10,000X SYBR זהבInvitrogenS11494
עטיפת פלסטיק למיקרוגלעטיפת
Safe Imager transilluminatorInvitrogenS37102
GELase Agarose עיכול ג'ל הכנהEpicentre BiotechnologiesG09100
אזמלפישר סיינטיפיק08-927-5D
Amicon Ultra-4 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם ממברנה Ultracel-10 EMDMilliporeUFC801024
Microcon YM-30 יחידת מסנן צנטריפוגלי EMD Millipore42410
מים ללא נוקלאזאמביוןAM9932
ערכת בדיקת Quant-iT PicoGreen dsDNA *2000 מבחנים*#InvitrogenP7589
מחמם בלוק יבש דיגיטליVWR בינלאומי12621-088
אמבט מיםVWR בינלאומי14231-854
צנטריפוגהבקמן קולטר בע"מ.רוטור צנטריפוגה Avanti J-E
בקמן קולטר בע"מJA 5.3
צנטריפוגה שולחניתEppendorf5415D
צינורות מיקרוצנטריפוגה, 1.7 מ"ל,Axygen ScientificMCT-175-C
15 מ"ל פישר סיינטיפיק430052
<חזק>שלב III
LB מרקפישר סיינטיפיקBP 1426-2
MgSO4Sigma-AldrichM2643
דילול פאג'ים10 מ"מ Tris-HCl [pH 8.3], 100 מ"מ NaCl, 10 מ"מ בקבוקונים MgCl2
cryogenicFisher Scientific430488
שלב IV
96 צלחת באר עם מכסהFisher ScientificCS003370( 3370)
384 צלחת באר עם מכסהפישר סיינטיפיק07201157(3680)
צלחות פטרי 100 OD x 15 מ"מ HFisher Scientific08-757-12
צלחות פטרי 150 קוטר x 15 מ"מ Hפישר סיינטיפיק08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 X 245 מ"מVWR בינלאומיCABD351040
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G5516
כלורמפניקולסיגמא-אולדריץ'C0378
LB מרקפישר סיינטיפיקBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
חרוזי זכוכיתפישר סיינטיפיק10-310-1
QFill3GenetixX3050
אקונומיקהJavex
אתנולSigma-AldrichE7023
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לפישר סיינטיפיק430052
QPix קוטף מושבותGenetixQPix2
(E. coli) GenetixX4006
ריצהפרימיום Saran צינורות צנטריפוגה שקופים מאגר ראש קטיף

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Environmental Genomic LibraryFosmid Library ProductionPulsed Field Gel ElectrophoresisDNA End RepairGel ExtractionPhage PackagingAutomated Colony PickingChloramphenicol SelectionEPI300T1 Resistant CellsQpix2 Robot

Related Articles