הבידוד של איכות גבוהה, RNA שלם הוא צעד חיוני בפרוטוקולים מעבדה רבות. הנה, אנחנו מדגימים מיצוי RNA מעוברים דג הזברה כולו סינתזה cDNA עבור יישום עוקבת הפרוצדורות השונות כולל ניתוח ביטוי גנים microarray.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים
במאמר זה
סיכום
תקציר
רבים הליכי מעבדה חשוב ומורכב דורשים קלט גבוהה, RNA איכות ללא פגע. מדגם מושפל או נוכחות של זיהומים יכול להוביל לתוצאות הרסניות ביישומים ניסיוני במורד הזרם. לכן, חשיבות עליונה להשתמש בטכניקות מוצק עם אמצעי הגנה רבים ושליטה בדיקות איכות כדי להבטיח מדגם מעולה. בזאת, אנחנו פרט פרוטוקול לבודד RNA סך מעוברים דג הזברה שלם באמצעות denaturant כימיים זמינים מסחרית ניקוי הבאים כדי להסיר עקבות של דנ"א זיהומים באמצעות ערכת בידוד מסחרי RNA. כאשר RNA הוא יציב יחסית ונוטים בקלות מחשוף ידי RNAses, ברוב הפרוטוקולים גן assay ביטוי בשימוש במוצר cDNA כי הוא מסונתז ישירות מתבנית RNA. אנו בפירוט הליך להמיר RNA לתוך המוצר cDNA יציבה יותר בעזרת ערכת זמינים מסחרית. במהלך הליכים אלה ישנם רבים בדיקות בקרת איכות כדי להבטיח כי המדגם הוא לא מושפל או מזוהמים. המוצר הסופי של פרוטוקולים אלה cDNA כי הוא מתאים microarray לניתוח, RT-PCR או אחסון לטווח ארוך.
פרוטוקול
חלק 1: הפקת רנ"א סך באמצעות מגיב TRIzol
כאשר עובדים עם RNA חשוב מאוד לעבוד בסביבה ללא RNAses. אמצעי זהירות פשוטים כגון הצורך pipettes שמורות לשימוש רק עם נהלים רנ"א לרסס את אזור העבודה עם ריאגנט decontaminant (למשל, RNAse משם) לפני תחילת ההליך מועילים מאוד.
- כדי להשיג כמות מספקת של RNA בריכה 50 עוברי דג הזברה בתוך צינור 1.5 microfuge מ"ל ולהסיר כמו מים כמה שיותר עם טפטפת.
- מיד להוסיף 250 μl של מגיב TRIzol 1 עד הצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השבריריות של מולקולת רנ"א הוא השיקול הקריטי ביותר, כי יש לזכור לאורך כל פרוטוקול זה. ציוד סטרילי כי הוא RNAse ללא יש להשתמש תמיד באזור RNAse חינם של המעבדה. זה עוזר לשמור חלק במעבדה לשמש הליכים RNA בלבד. אזור זה צריך להיות מרוסס לעיתים קרובות עם מוצר RNAse הסרת, כגון RNAse Away. דגימות רנ"א צריך תמיד להיות מטופלים עם כפפות כל הזמן על הקרח כדי למנוע השפלה.
פרוטוקול זה ניצלו ריאגנטים וערכות זמינים מסחרית........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| גליקוגן (5 mg/ml) | Ambion | 9510 | |
| NanoDrop ND-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-1000 | |
| עלי המוחץ עם מבחורות מיקרוצנטריפוגה | VWR international | KT749520-0090 | |
| Phase Lock Gel Light, 1.5 ml | Eppendorf | 2302800 | |
| פנול, רווי Tris | Roche Group | 3117944001 | |
| RNAse Away | VWR international | 17810-491 | |
| ערכת DNase נקייה מ-RNAse | Qiagen | 79254 | |
| ערכת RNEasy Mini | Qiagen | 74104 | |
| מערכת SuperScript® לסנתזה של הגדיל הראשון עבור RT-PCR | Invitrogen | 11904-018 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 |
מקורות
- TRIzol Reagent Manual. , (2007).
- RNEasy Mini Handbook. , 4th ed, (2006).
- SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Version E. (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
