Method Article

Denaturing polyacrylamide דשן ג'ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

DOI:

10.3791/1485

⸱

October 29th, 2009

 ,  , 
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore - NTU, 2Singapore-MIT Alliance for Reserach and Technology (SMART)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה משמשת נפרד חד גדילי דנ"א או רנ"א עד לגבול של 500 נוקלאוטידים. אוראה בשילוב עם denatures דגימות חום גדילי יחיד מובנה נודדים בתוך המטריצה ​​ג'ל לפי משקל מולקולרי שלהם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PAGE דשן או denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה מעסיקה 6-8 אוריאה M, אשר denatures DNA משני מבנים או RNA, והוא משמש להפרדה שלהם במטריצה ​​polyacrylamide ג'ל על בסיס משקל מולקולרי. שברים בין 2-500 בסיסים, עם הבדלי אורך קטנים כמו נוקלאוטיד יחיד, ניתן להפריד בשיטה זו: 1. ההגירה של המדגם תלוי בריכוז acrylamide הנבחר. אחוז גבוה יותר של polyacrylamide פותר שברי משקל מולקולרי נמוך. השילוב של אוריאה וטמפרטורות של 45-55 מעלות צלזיוס בזמן הריצה ג'ל מאפשר להפריד את ה-DNA לא מובנים או מולקולות RNA.

באופן כללי שיטה זו נדרש לנתח או לטהר גדילי דנ"א בודדות או קטעי RNA, כמו oligonucleotides או מוצרים מסונתז או תווית של תגובות אנזימטיות מחשוף.

במאמר זה אנו מציגים וידאו כיצד להכין ולהפעיל polyacrylamide ג'לים denaturing אוריאה. טיפים טכניים כלולים, בנוסף 1,2 הפרוטוקול המקורי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול טקסט מלא ומפורט עבור הליך זה ניסיוני זמין הפרוטוקולים נוכחי בביולוגיה מולקולרית. מפורט צעד אחר צעד הוראות הרכבה של הכריך ג'ל ועל מנגנון ג'ל ניתן למצוא באתר האינטרנט של BioRad 3.

ציוד חובה:
צלחות זכוכית (פנימית וחיצונית)
תא 10 ס"מ: 10.1 x 7.3 ס"מ (צלחת הפנימי), 10.1 x 8.2 ס"מ (צלחת החיצוני), BioRad
תא 20 ס"מ: 20 x 20 ס"מ (צלחת פנימי), 20 x 22.3 ס"מ (צלחת החיצוני), BioRad
0.5-1.5 ג'ל מסרק מ"מ מפרידי
ג'ל לעמוד הליהוק
ג'ל מנגנון עם מכסה וכבלים
כבלי מתח האספקה
חימום לחסו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. החדות הלהקה תלוי במספר גורמים. היקף המדגם טעון ללהקות חדה צריך להיות קטן ככל האפשר, כלומר באופן אידיאלי בין μl 1-5. עם זאת, עד 15 μl ניתן לטעון שעדיין מבטיח פתרון מקובל. פחות נפח דגימה תוצאות להקות חדות.
  2. איכות הלהקה תלוי גם בעובי ג'ל. ג'ל רזה יותר, כגון 0.75 מ"מ להראות תוצאות טובות יותר מאשר 1.5 ג'ל סמיך מ"מ.
  3. הצורה של להקות יכולים גם להי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האקדמי סינגפור (ARC) [מספר מענק 90/07]. אנו מודים Radiodurans על התמיכה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
  2. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Urea PAGEDenaturing Gel ElectrophoresisPolyacrylamide GelDNA RNA SeparationOligonucleotide AnalysisGel PreparationGel RunningSample LoadingGel FixationGel Imaging

Related Articles