במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור של תסיסנית הנוירונים ההיקפיים באמצעות מיון מהיר מגנטי חרוז בסיוע אסטרטגיה התא. RNA המתקבלים בתאים מבודדים יכול לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל ניתוחים microarray.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי
במאמר זה
סיכום
פרוטוקול
הערות כלליות על מיון ביד מגנטית של הנוירונים תסיסנית היקפיים (עיתוי סך להשלמת לפרוטוקול: 2.5-3 שעות)
נהלי מעבדה רגיל לשמירה על סביבה נקייה, RNAse חינם יש לשמור בכל עת על מנת למנוע הידרדרות RNA.
כאשר לציפורן הזחל תסיסנית הוא גזור והוכנסו למאגר תא דיסוציאציה, הנוירונים ההיקפיים הם אחד התאים האחרון להתנתק לציפורן. אנחנו צריכים לנצל את רכוש שנועד בפרוטוקול זה כדי להסיר את רוב הלא ספציפית של תאים לציפורן כגון שריר ושומן לפני לבודד את הנוירונים דה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המובא כאן הוא אופטימיזציה עבור בידוד וטיהור של נוירונים הפריפריה אשר להיצמד בחוזקה לפני השטח הפנימי של לציפורן third תסיסנית הזחל instar באמצעות מיון מגנטי חרוז אסטרטגיה התא. אמנם יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה במיוחד כדי לבודד תסיסנית נוירונים דה, יישומים של פרוטוקול זה לבידודה של סוגי תאים אחרים לדבוק לציפורן של הזחל גלמי או בשלבים של פיתוח (למשל epithelia, שריר, עצב היקפיים אחרים) ניתן להתאים על ידי משתנים כמה פרמטרים ושימוש GAL4 ברורים, כטב"מ-mCD8-GFP trans.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ו-Office ג'ורג' מייסון האוניברסיטה מכללה (EPRI).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
ציוד
- (10) לחסום מגנטים נאודימיום (K & J מגנטיות, Inc, חתול. # B444B), לחילופין DynaMag ™ -2 (Invitrogen, חתול. # 123-21D) עשוי לשמש.
- רקמות Kontes מלתעה זכוכית, 2 מ"ל כושר עבודה, עם העלי סיקול גדולה (קט # 885300-0002)
- תא מסננים, למשל MACS טרום ההפרדה סינון (Miltenyi BIOTEC, חתול. # 130-041-407)
- 35 מ"מ צלחות פטרי, מצופה Sylgard (Dow Corning Corporation, חתול. # 3097358-1004)
- כלים לנתח: שני זוגות של דומון מס '5 מלקחיים (כלים מדע טוב, חתול # 11251-20).
- Vannas באביב מיקרו לנתיחה מספריים (כלים מדע טוב, חתול. # 15000-08)
- Pipettes (P-1000, P-100, P-10) עם טיפים חד פעמיות
- Hemocytometer רגילה לספור את התאים טוהר אומדן
- Pipettes פסטר עם טיפים אש מלוטשת בקוטר סטנדרטי, צמצמה ל 50% ~ בקוטר סטנדרטי צמצמה ל 25% ~ בקוטר סטנדרטי טחינה דקה
- לוח צנטריפוגות מיקרו העליון (1-16,000 (x) ז)
- מערבולת
- פלורסנט סטריאו מיקרוסקופ (א MZ16FA לייקה נעשה שימוש בפרוטוקול זה)
מקורות
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
