Microinjection Intranuclear של דנ"א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

סיכום

הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.

תקציר

ראשי בתרביות תאים עצביים הם כלי רב ערך כדי ללמוד לתפקד חלבון כיוון שהם מייצגים מערכת יותר רלוונטי מבחינה ביולוגית לעומת שורות תאים הונצח. עם זאת, טבע פוסט mitotic של נוירונים העיקרי מונע חלבון יעיל הביטוי Heterologous באמצעות הליכים נפוצים כגון electroporation או כימית בתיווך transfection. לפיכך, טכניקות אחרות חייב להיות מועסק על מנת לבטא בצורה יעילה החלבונים האלה בתאים שאינם מתחלקים.

במאמר זה נתאר את הצעדים הנדרשים לביצוע זריקות intranuclear של מבנים cDNA לתוך ניתק נוירונים אוהד מבוגר. טכניקה זו, אשר הוחל על סוגים שונים של נוירונים, מצליח לגרום ביטוי חלבון Heterologous. ציוד חיוני עבור ההליך microinjection כוללת מיקרוסקופ הפוך לדמיין תאים, זריקת כוס pipet מלאים פתרון cDNA המחובר מערכת N _{2 (g)} משלוח לחץ, micromanipulator. Micromanipulator מרכזת את ההצעה הזרקת pipet microinjection עם הדופק קצרה של N ₂ בלחץ להוציא cDNA פתרון מקצה pipet.

טכניקה זו אין רעילות הקשורות הרבה שיטות transfection אחרים ומאפשר בונה DNA מרובים להתבטא ביחס עקבי. מספר נמוך של תאים מוזרק הופכת את ההליך microinjection גם מתאים מחקרים תא בודד כגון הקלטות הדמיה אלקטרו אופטית, אבל לא יכול להיות אידיאלי עבור מבחני ביוכימיים הדורשים מספר גדול יותר של תאים transfection יעילות גבוהה יותר. למרות microinjections intranuclear דורשים השקעה של ציוד הזמן, את היכולת להשיג רמות גבוהות של ביטוי חלבון Heterologous בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עושה את הטכניקה הזאת כלי שימושי מאוד לחקור את תפקוד החלבון.

פרוטוקול

I. הכנה הזרקה

סעיף זה מתאר את השלבים בהכנת כי יש לנקוט לפני הזרקת cDNA לתוך הגרעין של נוירונים. ההליך בידוד עבור נוירונים הוא מעבר להיקף של מאמר זה, אך חשוב להיות נוירונים ניתק לתוך תאים בודדים ועל דבקות טוב למשטח התחתון של תא 35 מנות מ"מ תרבות (ראה דיון על עצות מועילות להשגת מטרה זו). למרות מגוון רחב של נוירונים שונים העלול לשמש, הגרעינים היקפי כמו בגרעיני צוואר הרחם מעולה (SCG) או בגרעיני השורש הגבי הם העדיפו לנתיחה משום שהם נגישים בנוחות להניב מספר רב של נוירונים. יתרונות נוספים של שימוש נוירונים SCG הם כי הם אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאים היטב מאופיין ^1,2,3,4.

א הכנה של פלסמיד cDNA להזרקה

1. כדי למנוע זיהום או קלקול של ה-DNA, יש ללבוש כפפות במהלך תקופת ההכנה.
2. ה-DNA המקודד את החלבון של הריבית subcloned לתוך וקטור ביטוי מתאים של יונקים, כגון PCI (Promega, מדיסון, ויסקונסין), לפי תקנה של האמרגן מאוד פעיל constitutively ציטומגלווירוס (CMV). אם החלבון לא מסומן, לכתב פלסמיד, EGFP קידוד למשל (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, פאלו אלטו, קליפורניה), היא שיתוף הזריק זריקה כדי לאשר ביטוי מוצלח. DNA הוא מבודד באמצעות איכות גבוהה ההפרדה עמודה (למשל Midi-QIAfilter ערכת הכנה, Qiagen, Chatsworth, CA) וטיהר נוסף באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם מסנן PVDF (0.1 מיקרומטר, Millipore, בדפורד, מסצ'וסטס) כדי להסיר חלקיקים ב הכנה פלסמיד, שיכולה לחסום זריקה pipets במהלך תהליך ההזרקה. פלסמידים מאוחסנים ב -20 ° C בריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl ב חיץ האחסון המתאימה DNA (למשל חיץ TE: 10 mM טריס, 1 mM EDTA, pH 8.0).
3. בסמוך לפני microinjection, cDNAs פלסמיד הם בדילול מעורב לריכוז הסופי הרצוי TE חיץ או H ₂ O. בדרך כלל, 50-10 ng / μl של הגן הכתב די תווית התאים מוזרקים, ואת הריכוז הכולל של cDNA להיות מוזרק לא יעלה על 200 ng / μl מאז ה-DNA הוא צמיג בריכוזים גבוהים עלול להדביק pipets ההזרקה. נפח קטן של cDNA להזרקה (μl 50-10) הוא הוכן על ידי טיפות ערבוב של הפתרון על פני השטח נקי של חתיכה קטנה של Parafilm (צד מתחת לגבות את הנייר). מערבבים את טיפות של תמיסת יחד pipeting מעלה ומטה מספר פעמים עם pipetor ולמנוע החדרת בועות אוויר במהלך ערבוב.
4. שימוש pipet microloader קצה (Eppendorf, Brinkmann מכשירים, ווסטבורי, ניו יורק), להעביר את הפתרון cDNA לצינור המטוקריט שהוכנו במיוחד (פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה). ראה סעיף חומרי לקבלת הוראות על הכנת צינורות המטוקריט (לוח חומרים). מניחים את הצינור המטוקריט המכיל את פתרון cDNA הזרקה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
5. צנטריפוגה הצינור 15-30 דקות ב 000 גרם 10 microcentrifuge מצויד הרוטור דלי קבוע זווית או נדנוד (Eppendorf), בטמפרטורת החדר (20-24 ° C) לחלקיקים משקעים בפתרון cDNA אשר עלול לחסום את microinjection pipet. הפתרון הזרקת cDNA יכולים להישמר בטמפרטורת החדר במהלך הפגישה ההזרקה.

ב ייצור של הזרקה pipets

1. פנויה microinjection pipets זכוכית זמינים מסחרית (Femtotips למשל, Eppendorf), אשר נוח אך יקר (10 דולר pipet microinjection). Pipets הזרקת יכול להיות מיוצר במעבדה באמצעות P-97 לתכנות Flaming חולץ pipet בראון (החברה סאטר Instrument, Novato, CA) ואת filamented, דק דופן צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי (מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה). אפשרות זו היא חסכונית יותר ומאפשר שליטה על הצורה microinjection pipet וגודל.
2. בתוכנית שני שלבים משמש למשוך צר pipet טיפים microinjection. מאז פתיחת pipets microinjection צר מדי לבדוק תחת מיקרוסקופ אור, איכות pipets הזריקה חייבת להיבדק באופן ישיר על ידי הזרקת תאים ספורים לפני הגדרות התוכנית הם סופיים. להלן הגדרות המשוער עבור הגדרות, חום למשוך, מהירות וזמן: (למשוך 1) 600, 115, 15, 250; (למשוך 2) 640, 130, 65, 200. הגדרות אלה משתנות עם קבוצות שונות של זכוכית על ידי מצבו של החוט חימום חולץ, וצריך להיות מותאם לפי הצורך. לפרטים נוספים ראה ^5.
3. משוך כמה (2-5) pipets הזרקה לכל צלחת של נוירונים להיות מוזרק, במקרה של נזק או בעיות במהלך הפגישה ההזרקה. חנות pipets ההזרקה במיכל מכוסה כדי למנוע אבק מלהיכנס קצה pipet microinjection.

השנייה. Intranuclear microinjection

"אוהל> סעיף זה מפרט את התהליך של הזרקת cDNA לתוך הגרעין של נוירונים. microinjection בסיסי הגדרת כוללת מיקרוסקופ הפוכה שלב ניגודיות (למשל ניקון Diaphot TMD, ניקון, מלוויל, ניו יורק) כדי להמחיש את התהליך, micromanipulator (למשל Eppendorf 5171) כדי לשלוט על תנועת pipet הזריקה לחץ ההזרקה (למשל Eppendorf FemtoJet אקספרס) לגרש את הפתרון cDNA מ pipet. חיבור לחץ ההזרקה כדי micromanipulator מאפשר סנכרון של שני התהליכים האחרונים במהלך זריקות. אחרות אופציונלי, אך מומלץ מאוד, כוללים רכיבים ניטור רכוב מערכת וידאו (מצלמת CCD, Cohu Inc, בסן דייגו, קליפורניה; שחור ולבן וידאו לפקח, Sony Corporation, טוקיו, יפן). מערכת זו אינה דרישה מוחלטת זריקות; עם זאת, צג שחור לבן מציעה ניגודיות גבוהה עבור להדמיה משופרת של גרעין התא מציעה חוויית צפייה נוחה יותר במהלך הפגישות הזרקה רב. בנוסף, המחשב הנייד פועל תוכנה להפעלת בקר כף יד יכול להיות מנוצל כדי למחצה להפוך את תהליך ההזרקה (ראה דיון לפרטים נוספים).

הזמן האידיאלי להזריק נוירונים SCG הוא 3-6 שעות שלאחר ניתוק. בשלב זה, התאים הם כדוריים, מחוברת בחוזקה אל החלק התחתון של המנה, ואת הגרעין נראה בבירור, תחת מיקרוסקופ שלב לעומת זאת, כמו מרכזי עגול אברון עם קרום כהה, המכיל nucleoli בודדות או מרובות (איור 1A).

1. מניחים צלחת של נוירונים ניתק במרכז הבמה מיקרוסקופ. התאם את המיקוד לייעל את הניגוד שלב האופטיקה של המיקרוסקופ כך גרעינים של נוירונים הם נראים בבירור.
2. 2 Pipet μl של פתרון cDNA שהוכן לתוך pipet microinjection באמצעות קצה pipet microloader. הימנע עריכת פתרון קרוב לתחתית של התחתית המטוקריט שכן הדבר עלול לעורר חלקיקים כי התיישבו במהלך צנטריפוגה. נימה של pipets microinjection צריך עזרה בציור פתרון קצה, אך אם בועות אוויר קטנות נמשכות, קפיצי בעדינות את הצד של הזכוכית כדי לסלק אותם.
3. הכנס את pipet microinjection לתוך מחזיק נימי של לחץ ההזרקה ולאחר מכן כדי להבטיח את בעל micromanipulator. בעל קבוע בזווית של ° 45.
4. מנמיכים את pipet microinjection לתוך המנה. כפי pipet נכנס בינוני תרבות, המניסקוס נוצר המשפיעה על שבירה של אור מוריד את איכות התמונה של הנוירונים. כדי להקל על בעיה זו, בצריח טבעת שלב ניתן לקזז מעט עד גרעינים של נוירונים גלויים לעין שוב.
5. יש מערכות הזרקת הלחץ יש תפקיד "נקי" כי חל לחץ האוויר המקסימלי מקצה microinjection pipet למשך זמן קצר. השתמש בפונקציה זו כדי לנקות את pipet של פסולת לפני תחילת במהלך זריקות אם את קצה מופיע סתומים. אם נוזל הפיג אינו גלוי על המסך, תוך שימוש בפונקציה זו, להחליף עם pipet זריקה חדשה.
6. המרכז pipet microinjection לפקח על צפייה ליישר את קצה ליד נוירון ועל המטוס מוקד זהה nucleolus. קביעת עמדה זו כמו להגביל את Z-ציר נמוך micromanipulator. עמדה זו היא העומק pipet microinjection יהיה להתקדם במהלך זריקות. עכשיו עמדת קצה כ 30 מיקרומטר מעל לנקודה זו ולכן pipet microinjection מנקה את החלק העליון של נוירונים.
7. "להזריק" מצב של micromanipulator Eppendorf 5171 יכולה להיות מוגדרת עם ההגדרות הבאות לבצע זריקות intranuclear. הפונקציה להזריק מוגדר על, בעוד פונקציה לדקור הוא הפסיק. שביל זריקה באלכסון (לאורך ה-X ו-Z ציר) מייצרת את הכמות המינימלית של נזק לתאים, ולכן במצב צירית אמור לשמש זריקות. מהירות הזריקה של 300 מיקרומטר / s מספיק, ולסנכרן את הלחץ הצטברות כאשר pipet microinjection מגיע להגדיר Z-ציר הגבול.
8. הלחץ ההזרקה שולט כמות פתרון cDNA מוזרק לתוך הגרעין. בכל מצב "אוטומטי" הזריקה, את המסירה של ה-DNA הוא זמן שבשליטת ביוזמת micromanipulator המחובר. הלחץ הזרקה (PI) צריך להיות מוגדר בין 100-200 hectopascals (hPa: 1 hPa ~ 0.015 psi); לחצי הזרקה גבוה לא לשפר את שיעורי ההצלחה או האיכות של זריקות עשוי להצביע על בעיות אחרות עם גודל pipet קצה microinjection או דנ"א טוהר . משך ההזרקה (TI) של 0.3 ו - s לחץ פיצוי (PC) של 30 hPa, המספקת לחץ חיובי קבוע, כדי למנוע כניסתם של occluding חלקיקים מן המדיום תרבות לתוך קצה pipet, אמור לשמש.
9. מקם את נוירון להיות מוזרק תחת קצה pipet microinjection באמצעות xy ציר של מיקרוסקופ בקרת הבמה. יישר את קצה pipet לעיל במרכז הגרעין ידי התמקדות הלוך ושוב בין tהוא קצה ועל nucleoli.
10. הזרק את הגרעין ידי לחיצה על כפתור להזריק (על micromanipulator). עבור השלב הזרקה, תנועת pipet microinjection ואת שחרורו של cDNA הפתרון נשלטים על ידי micromanipulator. קשה לאשר זריקות intranuclear מוצלח לפי העין, אבל את הזריקה של הפתרון צמיגות נמוכה יחסית cDNA (לעומת הסביבה גרעיני צמיגה), לעתים קרובות מופיעה נוצה לבנה תחת שלב בניגוד אופטיקה יכול לשמש אינדיקטור הזרקה לתוך הגרעין. לפעמים pipet microinjection לא לחדור את קרום הגרעין פשוט דוחף את הגרעין. ניסיון זריקה שנייה תנוחה עשוי להוביל זריקה מוצלחת של ה-DNA לתוך הגרעין. נפיחות של התא מעיד בדרך כלל בהזרקה cytoplasmic מכוונת. כמו כן, נפיחות גרעיני משמעותי אינו נסבל היטב על ידי נוירונים ובדרך כלל גורמת מוות של תאים זמן קצר לאחר מכן, ולכן הלחץ הזרקת ומשך לא יעלה על הערכים שהציע.
11. המשך על ידי הזרקת נוירונים מחדש את הבמה מיקרוסקופ כדי ליישר את הנוירון הבא תחת pipet microinjection. שיטתי לנווט המנה להזריק כ 50-100 גרעינים לפני החזרת צלחת של נוירונים אל האינקובטור עבור הדגירה לילה. נוירונים מוזרק בהצלחה ניתן לזהות למחרת על ידי הביטוי של הגן הכתב.

ג. נציג תוצאות

איור 1: סופיריור צוואר הרחם (SCG) נוירונים גנגליון.
בניגוד שלב תמונה של SCG נוירונים 3 שעות שלאחר ניתוק (A). בשלב זה, גרעין נראה בבירור אשר מסייע יישור קצה pipet microinjection. גרעין מופיע במרכז של נוירונים עם nucleoli (מימין) בודדת (משמאל) או מרובות כהה.
SCG נוירונים 16 שעות לאחר הזרקת EGFP cDNA לתוך הגרעין (B). השמאל, SCG נוירונים שנצפו תחת תאורה שלב ניגודיות. נכון, התמונה epifluorescent של הנוירונים אותו מראה זריקה מוצלחת כתוצאה ביטוי EGFP ב נוירון אחד.
בר לבן מידה הוא 20 מיקרומטר.

איור 2: Whole-cell הקלטות של זרמים דרך heterologously-G-חלבון לידי ביטוי בשילוב פנימית לתיקון K ⁺ (GIRK) ערוצים SCG נוירונים.
GIRK זרמים (אני _GIRK) היו מעוררים על ידי כבש ms מתח מ 200 ל -140 mV 40 מתוך פוטנציאל החזקת -60 mV (הבלעה של A) ההפעלה הבאה של אנדוגני α _{2-adrenoceptors} ידי ונוראפינפרין (NE, 10 מיקרומטר) . עקבות על גבי הקלטות מן הנוירון אותו עולה לפני (שחור) לאחר יישום לבד NE (כחול) או NE פלוס 10 mM Ba ^{2 +} (אדום). קווים מקווקווים מציינים את הרמה הנוכחית אפס.
להקלטת אני _GIRK, הפתרון חיצוני הכיל (מ"מ) 130 NaCl, KCl 5.4, 10 HEPES, 10 CaCl _2, 0.8 MgCl _2, 15 גלוקוז, סוכרוז 15, ו - 0.0003 TTX, מותאם pH 7.4 עם NaOH. פתרון הקלטה פנימית הכיל (מ"מ) 135 KCl, 11 EGTA, CaCl ₂ 1, 2 MgCl _2, 10 HEPES, MgATP 4, 0.3 ו - Na ₂ GTP, מותאם pH 7.2 עם KOH.
המחסור הנוכחי שהושרו על ידי הרמפה מתח בנוכחות NE ב uninjected נוירונים SCG (א) מוכיח כי נוירונים SCG אינם מבטאים ערוצי GIRK אנדוגני. זריקה מוצלחת של קידוד cDNA פלסמיד פונקציונלי GIRK ערוץ ¹¹ מעורר זרמים גדולים במהלך כבש את המתח כאשר הם נחשפים NE (B, משמאל). זרמים בעלי מאפיינים טיפוסיים של זרמים בערוצים GIRK: הפעלה על ידי אגוניסט G-חלבון קולטן מצמידים (NE), תיקון פנימה, ולחסום של זרמים ידי חוסם ערוץ המשוערת GIRK, Ba ^{2 +} (B, ממש זכר אדום). החוגים פתח ומילא מייצגים אני _GIRK על החזקת ואת השיא הנוכחי, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

דיון

בעיות נפוצות נתקל והצעות:

כפי שהוזכר קודם לכן, זריקות גרעיני מוצלח תלוי שיש תאים חסיד אל צלחות בתרבית רקמה. דחיית תחילת זריקות כמה שעות לאחר הליך תא דיסוציאציה מאפשר נוירונים לדבוק בתחתית הכלים. בנוסף, מנות עם ציפוי 0.1 מ"ג / מ"ל ​​של משקל מולקולרי גבוה פולי-L-ליזין (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) עזרי הידבקות של נוירונים על פני השטח התחתון של הכלים.

חסימה של pipets microinjection, במיוחד כאשר מנסים להזריק ריכוז גבוה של ה-DNA, יכולה להיות בעיה תכופים. באמצעות הפרדה גבוהה עמודות איכות לבודד ולטהר פלסמיד דנ"א, ואת ביצוע הפעולות טיהור נוספים שהוזכרו (מסננים ספין, מסתובב צינורות המטוקריט) יכול לעזור להסיר חלקיקים לפני הזרקה. במהלך זריקות, הפונקציה "נקי" של לחץ ההזרקה אפשר להשתמש (עבור s 0.2 מספיק), אבל אם זה לא פותר את הבעיה, pipet הזרקה חדשה יש להשתמש. אם רוב pipets microinjection להיות סתומים במהלך הפגישה זריקה, שקול לשנות את ההגדרות של חולץ pipet זכוכית כדי לייצר pipet טיפים microinjection עם פתח גדול יותר.

סוגיה נוספת שעולה במהלך זריקות גרעיני הוא חוסר האחידות של פני השטח התחתון של מנות בתרבית רקמה. השתנות זו משפיע ישירות על דיוק המיקוד של טיפים pipet זריקה לגרעין מאז עומק שחוצה pipet במהלך זריקות קבוע. לכן, להגביל את זה Z-ציר חייב להיות מותאם במהלך זריקות בתוך צלחת אחת. זה יהיה ברור כאשר התאמה הכרחית: לא תהיה אינדיקציה הזרקת גרעיני (לא נוצה לבנה או בגרעין התא הוא החמיץ לחלוטין), או קצה pipet הזרקת מתקרב לתחתית הקערה (דחיסת התא או אפילו את קצה pipet מתרסק לתוך החלק התחתון של המנה). זכוכית שיבוט צילינדרים (. OD 10 מ"מ, חתול מס '2090-01010, Bellco זכוכית, Vineland, NJ) יכול לשמש במהלך ציפוי של נוירונים להגביל אותם באזור קטן יותר מצומצם יותר, ולכן צמצום המרחק הנדרש כדי להעביר pipet בין הזרקת זריקות. גלילים אלה שיבוט יוסרו לפני ביצוע microinjections.

החסרונות של השיטה:

Microinjections Intranuclear הם תובענית מבחינה טכנית, אשר דורשים סבלנות רמה גבוהה של מיומנות ידנית על ידי המפעיל. בקיאות עם הטכניקה הזו, כמו עם מיומנות אחרת, מגיע עם התרגול. לכן, מומלץ לתרגל זריקות הגרעין של הגן כתב לבד לפני שתנסה ניסויים בפועל. כדי להמשיך ולסייע בתהליך הזרקה, יתכן שניתן יהיה לגבש את הצעדים של micromanipulator והלחץ מזרק לתוך תוכנת מחשב. תוכניות כגון איגור Pro (WaveMetrics, אגם Oswego, OR) יכול להיות מנוצל כדי לשמור הגדרות microinjection ו לתוכנית בקרי רב תכליתיים (ShuttlePro, קונטור עיצוב, ווינדהאם, NH) כדי למחצה להפוך את תהליך ההזרקה (ראה 6,7,8 עבור לפרטים נוספים).
חסרון נוסף של הטכניקה microinjection intranuclear הוא שיעור הצלחה נמוך. כ 10-20% של זריקות גרעיני ניסו להוביל ביטוי חלבון. בעוד יעילות זה עשוי להיות מספיק עבור יישומים שאינם דורשים מספר גדול של תאים לבטא, electrophysiology למשל, עבור מבחני ביוכימיים שונים זה עלול שלא להספיק.

יישומים של הטכניקה:

למרות חסרונות, microinjection intranuclear של ה-DNA הוא טכניקה שימושית מאוד עבור heterologously לבטא חלבונים נוירונים.

רמות גבוהות של ביטוי חלבון מושגות עם microinjections גרעיני בגלל מספר גדול של פלסמידים שוחרר לתוך הגרעין במהלך זריקות, מקדם מאוד פעיל CMV בוויסות שעתוק הגנים, יציבות ארוכה של פלסמידים בגרעין. חלבון על הביטוי הוא שימושי במיוחד דומיננטי שלילי בניסויים שבהם רמות גבוהות של חלבונים Heterologous נדרשים להכריע את חלבון אנדוגני. יתרון נוסף של intranuclear זריקות היא היכולת לספק את חלק עקבית של בונה cDNA לגרעין כאשר בונה מרובים מוזרקים. בעזרת שיטות transfection אחרים, קשה reproducibly להציג שיעור זהה של ה-DNA בכל לבנות לתוך תאים שונים בתוך התבשיל זהה בין transfections. הזרקה ישירה של פתרון cDNA לתוך הגרעין זה מבטל מקור שונות ומאפשר יחס של חלבונים הביע להיות titered ביעילות.

שיטות transfection מסורתית יש יעילות מוגבלת שלאחר mitotic תאים בגלל התאגדות נמוכה של דנ"א לתוך הגרעין ⁹ רעילות כימית הקשורים reag transfectionלהורים ^10. Microinjections גרעיני להתגבר על בעיות אלו על ידי החדרת חומר גנטי מכני לתוך הגרעין. למרות הטכניקה הזו הוא מעורב יותר, את היכולת ללמוד את ההשפעה של חלבון במערכת ביולוגית תפקודית, להשלים עם מסלולי איתות אנדוגני, יותר מפצה על אופיו מייגע של טכניקה זו.

כל הליכי הניסוי על בעלי חיים בוצעו בהתאם המכונים הלאומיים לבריאות של הנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידת סינון Ultrafree-MC	EMD Millipore	UFC30VV00	מסנן Durapore PVDF; גודל נקבוביות 0.1 μm
בופר TE	Quality Biological, Inc.	351-010-131	10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0
צינורות נימיים למיקרו-המטוקריט	Fisher Scientific	22-362-574	הכנה ללא הפריניזציה: השריה ב-100% אתנול למשך לילה. שטיפה יסודית במים דה-יוניים שלוש פעמים וייבוש של הזכוכית בתנור (95°C). חיתוך של צינורות ההמטוקריט הנקיים לחתיכות באורך 3-4 cm באמצעות סמן עם קצה יהלום, ואיטום של קצה אחד באמצעות להבה ופינצטה להחזקת הזכוכית. אחסון בכלי זכוכית נקי ומכוסה למניעת הצטברות אבק.
מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	5417 R	עם רוטור בעל זווית קבועה או רוטור סל (swinging-bucket)
טיפים לפיפט Microloader 20 μl	Eppendorf	5242 956.003
זכוכית נימית להזרקה מיקרוסקופית	World Precision Instruments, Inc.	TW120F-4	דפנות דקות עם פילמנט, קוטר חיצוני 1.2 mm, קוטר פנימי 0.9 mm, אורך 100 mm
מכשיר למתיחת מיקרופיפטים (Flaming/Brown Micropipette Puller)	Sutter Instrument Co.	P-97	עם פילמנט קופסת פלטינה-אירידיום (מק"ט FB330B)
מיקרוסקופ הפוך Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		עדשות אובייקטיב של ניגודיות פאזה (phase-contrast) ב-20x ו-40x, מותקן על שולחן בידוד רעידות
מצלמת CCD (Charge-coupled device)	Cohu Inc.	6410
מסך וידאו	Sony Corporation	PVM-122	שחור לבן, מסך 9”
מערכת מיקרו-מניפולטור	Eppendorf	5171
יחידה להזרקה מיקרוסקופית	Eppendorf	FemtoJet Express
בקר להזרקה מיקרוסקופית	Contour Design	S-PROV2	בקר מולטימדיה ניתן לתכנות
Igor Pro	WaveMetrics	Version 4.05A	תוכנת פקודות לשליטה בבקר ההזרקה המיקרוסקופית שנכתבה על ידי S. Ikeda