עצם הכנת Undecalcified עבור היסטולוגיה, Histomorphometry וניתוח Fluorochrome

סיכום

היסטולוגיה עצם Undecalcified מספק מידע חשוב עבור מגוון של יישומים קליניים ומחקר. זה מאתגר מבחינה טכנית, בעיקר עם דגימות גודל גדול. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם.

תקציר

היסטולוגיה עצם Undecalcified מדגים את המיקרו ארכיטקטורה של העצם. זה מראה גם את הרכיבים mineralized ואת התאי של העצם, אשר מספק מידע חיוני על מחזור או עצם היווצרות העצם resorption. זה יש חשיבות עצומה במגוון רחב של יישומים קליניים ומחקר. זה מניב תמונות יפות ¹ ומאפשר טכניקות כגון הערכה fluorochrome ו histomorphometry ^2. ניתוח Fluorochrome היא טכניקה שבה צבעי ניאון אשר נקלטות על ידי סידן מוזרקים בנקודת זמן מסוימת, אשר מאפשרת כימות של כמות מינרליזציה באותו זמן נתון. Histomorphometry זהו תהליך של כימות העצם ברמה המיקרוסקופית.

עצם ביצוע היסטולוגיה undecalcified מבחינה טכנית מאתגרת, במיוחד עם דגימות גודל גדול. זה דורש שינויים טכניקה מאלה המשמשים פרפין תקן מוטבע היסטולוגיה. וידאו זה ממחיש את תהליך ייצור חלקים באיכות טובה מדגים את הקשיים הטכניים ושיטות שבה להתגבר עליהם. הכנת הדגימה, קיבעון ועיבוד מושגות עם באופן דומה רקמות רכות אחרות, אולם בשל לצפיפות וחדירות התחתון של עצם ניכרת קיבעון ארוך פי עיבוד נדרשים, לעיתים לוקח מספר שבועות. הטבעת מושגת באמצעות מדיום תמיכה עם קשיות דומה או שווה צפיפות העצם כגון methacrylate מבוססי שרפים, אך בניגוד חדירת פרפין והטבעה, זהו צעד בלתי הפיך. חתך ניתן להשיג על ידי שחיקה אשר מייצרת חלק עבה, שהוא אופטימלי עבור מחקרים כגון ניתוח fluorochrome. זו מושגת באמצעות מיטב להב היהלום על macrotome. לחלופין, קטעים רזה יכול להיות מיוצר עבור מיקרוסקופ אור זו מושגת באמצעות microtome המזחלת עם סכין חדה מאוד. Microtome המזחלת מספק את הכוח יציבות נוספים הדרושים, בלוקים גדולים קשה. שרף חלקים מוטבע יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של כתמים, אשר הפגינו.

פרוטוקול

1. רקמה ממוקם מיכל אטום המכיל פוספט 10% שנאגרו פתרון פורמלין ^3. להבטיח חשיפה מינימלית לאור, אם ניתוח fluorochrome יש לבצעם, כמו fluorochromes הם רגישים לאור.
2. הקם אשר האוריינטציה של רקמת יידרש.
3. חתוך את הדגימה לגודל, בכיוון הנכון, באמצעות הלהקה ראה. ודא אמצעי בטיחות הם דבקו. הדגימה ממוקם מכן לתוך מיכל אטום, היקף אשר אמור להיות בערך עשר פעמים את גודל הדגימה להשיג קיבעון הולם. הדגימה צריך להישאר הפתרון פורמלין סך של בין שבוע עד שבועיים, בהתאם לגודלה. הוא הציע להשתמש רקמות מלאה לבדיקה למטרות אופטימיזציה.
4. בדיקת רקמות מתאים לתבנית הטבעה והמקום רקמה לתוך מיכל אטום המכיל אטום אתנול 70%.
5. תהליך הרקמה עולה ריכוזי אתנול, מיגון מאור ותחת תסיסה מתמדת.
   1. 70% אתנול 1 שבוע
   2. 80% אתנול 1 שבוע
   3. 90% אתנול 1 שבוע
   4. 100% אתנול 1 שבוע
6. הרקמה אינה מסומנת ולאחר מכן במשך שבוע 1 ב butanol, שוב מיגון מאור ותחת תסיסה מתמדת.
7. צפיפות של שרף ואת העצם צריך להיות מתאימים מקרוב. צפיפות שרף ניתן לשנות (ראה שלב 8) ואנו ממליצים הטבעה טיפוס המבחן הראשון כדי להבטיח את צפיפות נכונה. אנו משתמשים Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) עבור מיקרוסקופ אור וניתוח fluorochrome. אם אימונוהיסטוכימיה נדרש שרף אלטרנטיבה יש להשתמש כגון Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. הפתרון 7100 Technovit הכנה עשוי להיות מעורב עם aliquots קטן של הפתרון ריכוך המסופק עם ערכת, אם נדרש, אך לא יותר מ% 5 את עוצמת הקול של פתרון הכנה; בחוויה שלנו את הפתרון ריכוך נדרשת לעתים רחוקות. חלקים שווים של אתנול מוחלט נוזלי בסיס Technovit 7100 מעורבבים ויישומי לרקמה כפתרון חדירה מראש למשך 24 שעות וצמצום החשיפה אור בהתרגשות.
9. הפתרון חדירה אז הוא עשה את השימוש 1 hardener גרם לי (= 1 שקית) אשר מומס בנוזל 100 מ"ל בסיס. זה מחליף את הפתרון מראש חדירה מותר לחדור שבוע 1 תחת תסיסה מתמדת.
10. מניחים את התבנית לתוך הרקמה, עם פני משטח חיתוך למטה. ודא שיש שוליים (רצוי לפחות 5 מילימטרים) סביב הרקמה עבור שרף, זה מבטיח חוזק לחסום. מערבבים 15mls של פתרון 7100 הכנה Technovit עם 1 מ"ל של hardener II ויוצקים מסביב הדגימה בתוך התבנית ולכסות על ידי לפחות 5 millimietres. אשפרה יחל בתוך 2 שעות אבל תהיה שלמה בן לילה.
11. הרכבה מבוצעת אז בעיצוב בלוק גיבוי באמצעות Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). מערבבים Technovit 3040 ביחס נפח של 2 חלקים אבקה לנוזל חלק 1 להשיג נוזל צמיג. יוצקים Technovit 3040 לתוך ההפסקה בחלק האחורי של הבלוק לרמה של לפחות 2 מ"מ מעל הבסיס של הבלוק. לאחר כ -10 דקות עובש ניתן התקלף ולחסום את מוכנה.
12. צפיפות ולכן המאפיינים החנית של שרף methacrylate רגישים ללחות הסביבה בחדר. בלוקים ולכן צריך להיות מאוחסן dessicator.
13. חתך קרקע מייצרת חלקים גדולים יותר בין 20-50 מיקרומטר עובי. זה שימושי עבור ניתוח fluorochrome (ראה סעיף למטה) כמו בסעיפים עבה לייצר הקרינה בהיר. אבטח את להב היהלום macrotome. הוסף חומר סיכה, כמו רוח נפט למאגר על macrotome. אבטח את לחסום מהדק ו להתמצא ללהב. אפשר שחיקה להתרחש לאט (כ 20-30 דקות לכל קטע) להבטיח שימון הולם. החלק הראשון חושף את הפנים חיתוך orientates סעיף זה צריך להיות מושלך.
14. הסעיף הבא הוא הניח אז בשקופית Superfrost פלוס. בסעיף יש נטייה להתכרבל כך מומלץ למקם חלק שקית סנדוויץ' על זה ואז מחזיק אותו שטוח עם שקופיות אחר הידק במקום. זה ממוקם אז בין 60-80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לתוך באינקובטור של. זה מרכך את methacrylate ומסייע בסעיף לדבוק לשקופית באופן שטוח.
15. סעיף הקרקע ניתן לנקות ומלוטש כנדרש באמצעות נייר זכוכית חצץ דק בצורה עדינה.
16. Microtome המזחלת קיצוצים בסעיפים רזה, המספק את החלקים הטובים ביותר microsocopy אור. השתמש microtome המזחלת כפי שהוא הוסיף קשיחות, אשר נדרש לחיתוך אלה בלוקים קשה. לחילופין microtome סיבובי מופעל ניתן להשתמש. השתמש בלהב חד נירוסטה. עדיף יש שני להבים זמין כאחד ניתן חידד את השני משמש. הלהב צריך לעשות בזווית של 45 מעלות עם הבלוק. סוריכוך rface יכולה להיות מושגת על ידי החלת נייר רטוב כדי לחסום את הצורך. זה עלול לקחת כמה סעיפים על מנת להשיג את התנאים חיתוך הרצוי כדי להשיג קטע איכותי. בסעיף הוא צף אז על אמבט מים והניח בשקופית כמו 16 לעיל.
17. ריאגנטים מכתים מפורטים חומרים למטה. הפרוטוקולים מבוססים על בנקרופט ⁴ et al. עקב וריאציה עובי מומלץ לבצע אופטימיזציה כתמים בשקופיות הבדיקה. מכתים Rack עלול לגרום רקמות לצוף מעל השקופית כך להוסיף את הכתמים ישירות לשקופית שטוח ייתכן שתידרש. פרוטוקול זהה או מכתים מתלה הוא הכרחי עבור תוצאות עקביות מכתים נדרש histomorphometry.
    1. Haematoxylin ו Eosin
       1. הכתם עם 5-10 דקות Haematoxyilin
       2. לשטוף היטב עם מים מהברז של סקוט
       3. הכתם עם Eosin 5 דקות
       4. לשטוף במי ברז
       5. נקה קסילן
       6. הר
       7. תוצאות
          1. דמוי עצם = ורוד
          2. עצם מסויד = חום אדמדם
          3. כחול = גרעינים
    2. פון Kossa
       1. מקום תמיסת כסף חנקתי ולחשוף לאור חזק עד העצם mineralized הופך שחור (10 דקות בערך)
       2. לשטוף במים מזוקקים שלוש פעמים
       3. איום עם thiosulfate נתרן במשך 5 דקות
       4. לשטוף במים מזוקקים
       5. Counterstain עם Safrinin O
       6. נקה קסילן
       7. הר
       8. תוצאות
          1. עצם Mineralised = שחור
          2. דמוי עצם = אדום / ורוד
    3. מאסון גולדנר s Trichrome
       1. לשטוף עם אלכוהול אלקליין (90mls של 80% אתנול ו 10mls של אמוניה 25% למשך 20 דקות)
       2. לשטוף במים
       3. שטפו במים מזוקקים
       4. הכתם עם Haematoxylin Weigert של 10 דקות
       5. שטפו במים מזוקקים
       6. הכתם עם הפתרון הסופי Ponceau-Fuchsin 5 דקות
       7. לשטוף עם חומצה אצטית 1% 15 שניות
       8. כתם phosphomolybdic חומצה כתום פתרון G 5 דקות
       9. לשטוף עם חומצה אצטית 1% 15 שניות
       10. כתם אור ירוק 5 דקות
       11. לשטוף עם חומצה אצטית 1% 3 שינויים
       12. שטפו במים מזוקקים
       13. הר
       14. תוצאות
           1. עצם Mineralised = ירוק
           2. דמוי עצם = אדום / כתום
           3. = גרעינים כחול אפור
           4. סחוס = סגול
18. Fluorochrome ההכנות:
19. אלה בזריקה תוך ורידי איטי, לפחות שבועיים זה מזה.
20. מינון
    1. Calcein גרין 10 מ"ג / ק"ג IV
    2. Oxytetracycline 50 מ"ג / ק"ג IV
    3. Alizarin Complexone 30 מ"ג / ק"ג IV
21. הכנת Calcein גרין
    1. גרם אחד של Calcein הירוק הוא טיטרציה עם NaOH 1 M עד שהיא נמסה.
    2. ה-pH מותאם עם NaOH 1% עד pH = 7.1-7.2.
    3. סינון לשמור מוגן מפני האור
22. הכנת Alizarin Complexone
    1. שלושה גרם של Alizarin complexone היא טיטרציה עם NaOH 1 M עד שהיא נמסה.
    2. ה-pH מותאם אז עד pH = 7.1-7.2 עם HCl או NaOH 1%.
    3. סינון לשמור מוגן מפני האור
23. הכנת Oxytetracycline
    1. Oxytetracycline זמין כתרופה אנטי מיקרוביאליים מהמדף. הכנה לא נדרש.

חומרים

ממיסים:

• 10% Normal שנאגרו חומצה אתנול פורמלין, קסילן Butanol
  כל כיתה היסטולוגיה, ללא גופרית.
  Grale מדעי Pty בע"מ
  http://www.grale.com.au

Moulds:

• פיל משם, תבניות פלסטיק
  Grale מדעי

שקופיות:

• SUPERFROST PLUS שקופיות מיקרוסקופ
  לומב מדעי Pty בע"מ
  http://www.lomb.com.au

שרף:

• GlycolMethacrylate Technovit 7100
  Heraeus Kulzer
  http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm
• גיבוי שרף-Technovit 3040 בלוק בלוק histo
  Heraeus Kulzer

כתמים
(ריאגנטים מ Grale מדעי)

Trichrome גולדנר של כתם

1. Weigert של ברזל hemotoxylin (DeGroat)

א) Hemotoxylin פתרון
Hemotoxylin	1g
Absolute אלכוהול	100 מ"ל
ב) ברזל פתרון
30% כלור וברזל מימית	4mL
חומצה הידרוכלורית (מרוכז)	1mL
מים מזוקקים	95mL

מסוננים והוסיף נפח שווה של hemotoxylin מיד לפני כתם בשימוש.

2. Ponceau-fuchsin-azophloxin מניות פתרונות

א) Ponceau דה פתרון xylidine
Ponceau דה xylidine	0.75g
חומצה fuchsion	0.25g
חומצה אצטית	1mL
לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (100 מ"ל)
ב) azophloxin פתרון
Azophloxin	0.5g
חומצה אצטית	0.6mL
לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (100 מ"ל)
ג) פתרון סופי עבודה כתם
Ponceau-fuchsin פתרון	5-10ml
Azophloxin	2ml
0.2% חומצה אצטית פתרון	88mL

3. הפתרון אור ירוק

אור ירוק	1g
חומצה אצטית	1mL
לערבב, ולהוסיף מים מזוקקים (500ml)

4. Phophomolybdic חומצה אורנג' G פתרון

Phosphomolybdic חומצה	3g
אורנג' G	2g
להמיס 500ml של מים מזוקקים ולהוסיף תימול קריסטל.

פון Kossa כתמים

1% חנקת הכסף מימית

נתרן 2.5% thiosulfate

1% safranin O

Alcian כתם כחול

Alcian כחול 8GX	1g
3% חומצה אצטית פתרון	100 מ"ל

Hemotoxylin ו Eosin כתם

א) האריס hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5G
Absolute אלכוהול	25mL
אשלגן אלום	50 גרם
מים מזוקקים	500ml
כספיתי תחמוצת	1.25g או
נתרן iodate	0.5g
חומצה אצטית קרחונית	20mL
ב) Eosin פתרון
Eosin המיוצר מסחרית היה בשימוש.

כל אבקות צבע הכתם הם Gurr אבקות צבע.
ריאגנטים כל ריאגנטים אנליטיים, ולא מעבדת ריאגנטים

Fluorochromes

יצרן	Fluorochrome	מספר קטלוגי
סיגמא אולדריץ, סידני	Calcein גרין	C0875
סיגמא אולדריץ, סידני	Alizarin Complexone	A3882
Intervet אוסטרליה, ויקטוריה	Oxytetracycline (את התרופה מדף מיקרוביאלית)	Tradename; Engemycin 100