הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/1710

⸱

15 באפריל 2010

 ,  ,  , 
1NMR Surgical Laboratory, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Burn Institute, 3Department of Radiology, Athinoula A. Martinos Center of Biomedical Imaging, Harvard Medical School, 4Molecular Surgery Laboratory, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

טכניקה זו מאפשרת את השימוש זווית ברזולוציה גבוהה קסם ספינינג פרוטון MR ספקטרוסקופיה (HRMAS 1H-MRS) לאפיון מולקולרי של חיים תסיסנית melanogaster עם קונבנציונלית 14.1 טסלה ספקטרומטר מצויד בדיקה HRMAS.

תקציר

ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג (HRMAS) פרוטון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית (

פרוטוקול

חלק 1: תסיסנית הכנה מדידות HRMAS

  1. באמצעות תקן flylab נהלים 1, לאסוף החדש eclosing זבובים במשך 3 ימים ולהעביר אותם לטוס צלוחיות המכילות מזון לעוף טרי. דגירה הזבובים שנאספו במשך 5 ימים, כך הזבובים יהיה 5-8 ימים רק לפני הניסוי. רק מין אחד (בדרך כלל גברים) משמש עבור ניסויים.
  2. השתמש בריאים, סוג בר שלם זבובים להשוות עם טיפול בטראומה למשל או שינו גנטית זבובים 1.
  3. המקום זבובים בודד לתוך צינורות 2ml המכילה פיסה (~ 0.2ml) של מזון לטוס 24 שעות לפני הניסוי. צינורות אלה לשאת חור כוס הצינור עשוי באמצעות מחט להבה מחומם אינסולין.
  4. לשקול את הצינורות מיד לפני ואחרי הכניסה את הזבוב באמצעות איזון דיוק גבוהה להגדיר משקל של כל זבוב ידי הפחתת הערך הראשון של הלה. זבוב זכר יחיד שוקל בדרך כלל 0.7-1 מ"ג.

חלק 2: הכנת HRMAS רוטור.

  1. המקום צינור יחיד על קרח פחות מדקה להרדים בתוך לעוף.
  2. הנח את זבוב על שכבה של נייר אלומיניום דגש על קרח לדחוף בעדינות לטוס לחלל חלול semispherical של להכניס את הרוטור NMR בעזרת מברשת רכה כדי להבטיח חיבור לעוף שלם, תוך הימנעות מפגיעה לעוף.
  3. מניחים את להכניס תחמוצת זירקוניום (ZrO 2) צינור הרוטור (4 מ"מ קוטר, 50 μl) כדי לאתר את הזבובים בין להכניס את הרוטור התחתון של הרוטור (ראה figure1).
  4. סגור את הכנס עם בורג ולכסות אותו עם parafilm (ראה figure1) כדי למנוע את המגע בין זבוב לבין פתרון סטנדרטי כפית (כפית: trimethylsilyl-propionic-2-D4 ,2,3,3 חומצה, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 מ"מ deuterated מים-D 2 O, כי הפונקציה כהתייחסות למשמרת הן תהודה כימיים וכימות).
  5. הוסף 8 μl של פתרון כפית רגילה על גבי להכניס את הרוטור. (ראה תרשים 1).
  6. Secure והדק את כל להגדיר את הרוטורים עם כובע העליון (ראה תרשים 1).

חלק 3: HRMAS Data Acquisition

  1. הציגו את הרוטור לתוך החללית HRMAS ומקם אותה בזווית הקסם 54.7 ° (ראה איור 1).
  2. קביעת הטמפרטורה 4 מעלות צלזיוס על ידי יחידת BTO-2000 בשילוב עם יחידת MAS פנאומטי. זבובים נשמרים בעוד 4 מעלות צלזיוס בתוך הספקטרומטר לשמור על הרדמה.
  3. הגדר את H 1 HRMAS שיעור ספינינג גברת ב 2 MAS קילוהרץ.
  4. לייצב את התדר MAS סיבוב ב 2.0 ± 0.001 kHz על ידי בקר MAS מהירות (תדירות סיבוב).
  5. עבור הכנת מגנט: המנגינה ולהתאים את סליל עבור ביצועים אופטימליים פחית מגנט באיכות אופטימלית של הספקטרום.
  6. לרכוש את אחת ספקטרה ממדי 1 H באמצעות הרוטור מסונכרן קאר, פרסל, Meiboom-גיל (CPMG) ספין הד הדופק רצף 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) n-רכישה], אשר פועל כמסנן T 2 ל להסיר את הרחבת הספקטרום 1 H NMR יחיד לטוס ספקטרה כדי רכשה חד ממדי נתונים על כל הדגימות. סנכרן את העיכוב בין דופק (τ = 500μs) לתדר MAS את הסיבוב (2 קילוהרץ). הגדר את מספר הארעיים ב 256 עם 32,768 (32K) נקודות נתונים. זמן רכישת 9 דקות.
  7. רוכשת דו ממדי (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR יחיד לטוס ספקטרום על כל הדגימות באמצעות רצף TOBSY עם פולסים adiabatic 3. הפרמטרים רכישת הם: 2k נקודות נתונים מימד ישיר (11 עמודים לדקה רוחב הספקטרום), 1 של מים מראש הרוויה במהלך העיכוב הרפיה, 8 סריקות לכל תוספת, במרווחים של 128, זמן החזרה סך של 2, 45 ms זמן ערבוב, רכישה בסך הכל זמן של 29 דקות.

חלק 4: עיבוד נתונים / ניתוח

  1. ניתוח של דגימות MRspectra MestReC באמצעות תוכנה (Mestrelab המחקר, www.mestrec.com)
  2. השתמש קו הרחבה פונקציה apodization של הרץ 0.5 וחלים על כל 1 FIDs HRMAS H לפני השינוי פורייה.
  3. הפניה ספקטרה MR ביחס כפית עמודים לדקה δ = 0.0 (תקן חיצוני).
  4. שלב ספקטרום ידני ולהחיל אומד הבסיס וויטאקר תפחית את הרכיבים רחב של הבסיס לפני החישובים אזור השיא.
  5. אומדן שטחים שיא באמצעות תוכנת MestReC. סולם גבהים שיא ביחס כפית עבור כל קשת רכשה (כפית גובה שיא = 1). השתמש t-בדיקות (שני זנב, p <0.05), להשוות בתוך הקבוצה בין קבוצות יחסים.
  6. 2D פרמטרים TOBSY התהליך הם: QSINE = 2 פונקציה חלון בשני המימדים, FT עם נקודות 2k בממד ישיר אפס מילוי כדי 1k בממד השני, תיקון פאזה בשני הממדים תיקון הבסיס בממד השני.
  7. לייצר את ספקטרום 2D באמצעות ספרקי התוכנית (TD גודארד ו DG Kneller, ספרקי 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/בית / ספרקי /)

חלק 5: ספקטרה נציגת חיים תסיסנית melanogaster זבובים

הנהלים שתוארו לעיל היתר לאסוף ספקטרה לשחזור מתוך לחיות זבובי תסיסנית melanogaster. איורים 2 ו -3 מראים נציג MR ספקטרה שנרכש wild-type (wt) אורגון-R זבובים. תרשים 2 מציג 1D 1 H ספקטרה HRMAS CPMG. השומנים המרכיבים העיקריים [ג H 3 (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm)], גליצרול (1,3 C-H ו - 4.10 ppm 4.30 עמודים לדקה; 2-CH 2 5.24 ppm), ומטבוליטים קטנה: β-אלאנין (β-עלא , 2.57 ppm), אצטט (AC, 1.97 ppm), phosphocholine (PC, 3.22 לדקה) ו phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) התגלו והוצב על פי הדיווחים לפני 4, 5. איתותי עמודים לדקה 2.02 חולקו פרוטונים מתילן של מחצית H2-CH = CH-C של מונו חומצות שומן בלתי רוויות (כלומר palmitoleic). חומצות בלתי רוויות זוהו על ידי אות עמודים לדקה 5.33 המיוצר על ידי פרוטונים של מחצית-CH-CH =. מטבוליטים קטנים שלא ניתן היה מוקצה, או שלא נראו באמצעות ספקטרום 1D התגלו באמצעות 2D 1 H-1 H TOBSY HRMAS (ראה איור 3).

איור 1
באיור 1. ניסיוני להגדיר של in vivo HRMAS 1H גברת לחקירת לחיות תסיסנית על חומצה 14.1 ,2,3,3-D4 ט חיצוני סטנדרטי trimethylsilyl-propionic-2 במים deuterated (כפית / D 2 O). בכיכר: מיקום הרוטור בזווית קסם HRMAS בדיקה.

איור 2
איור 2. Vivo ב 1D HRMAS ספקטרה 1 CPMG H של זבוב חי תסיסנית wt melanogaster. שומנים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58ppm), אצטט (AC), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), β-אלאנין (β-עלא), phosphocholine (PC) ו phophoetanolamine (PE), גליצרול (1,3 C-H 4.10, 4.30 עמודים לדקה; 2-C H 2 5.22 ppm) , C = C H H (5.33 ppm).

איור 3
איור 3. Vivo 2D 1H-1H TOBSY ספקטרום HRMAS של זבוב תסיסנית לחיות wt melanogaster ב 14.1 מטבוליטים ט קטנים ורכיבים השומנים זוהו. מטבוליטים: אלאנין (עלא), β-אלאנין (β-עלא), ארגינין (Arg), גלוטמין (Gln), גלוטמט (Glu), phosphocholine מחשב (PC), phophoetanolamine (PE), טאורין (טאו), α-גלוקוז (α-Glc) ו גליצרול. ליפידים מרכיבים: C 3 H (0.89 ppm), (ג H 2) n (ppm 1.33), C H 2 C-CO (1.58 ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C = C H H (5.33 ppm).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למעט הדוח האחרון של היתכנות של MRI in vivo בפרי זבובים 6, in vivo גברת לימודי תסיסנית טרם דיווחו. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את יישום רומן בגישה vivo HRMAS H-1 גברת לאיתור מולקולות חשובות מבחינה ביולוגית. במפורש, זיהינו שומנים מטבוליטים קטנים לחיות תסיסנית זבובים ב 14.1-T ב כ 45 דקות, המאפשר רכישת זמן הולם, תוך השגת התמותה לטוס אפס. השימוש רוטור-מסונכרן נקניקיות-8 adiabatic הדופק (C9 1 15) ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית החולים הכללי מסצ'וסטס ועדת המחקר מוסדיים בעלי חיים הדירקטוריון סקירה.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) כדי להעניק AI063433 לורנס ג רחמה, מכון המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מרכז גרנט (P50GM021700) כדי רונלד ג טומפקינס (א 'אריה ציקה, מנהל הליבה NMR), ובית החולים של שריינרים לילדים מענק מחקר (# 8893) א 'אריה ציקה. אנו מודים Dionyssios Mintzopoulos Ph.D. סיוע בשלבים הראשונים של פיתוח זה פרוטוקול Ovidiu ג Andronesi Ph.D. לקבלת סיוע עם רצף הדופק TOBSY.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דהוטריום אוקסידריאגנטSigma-Aldrich7789-20-0
3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 חומצהריאגנטSigma-Aldrich24493-21-8
אגר, סוכרוז, שמרים, קמח תירסמזוןGenesee Scientifichttp://www.flystuff.com/
זבובים מסוג Oregon RS או Canton-Sקווי זבובים בוגריםמרכז מאגרי הזנים של בלומינגטון (Bloomington Stock center)http://flystocks.bio.indiana.edu/
מכחולציוד(גודל 0)
מבחנות של 2 מ"לציודFisher ScientificK749521-1590
אינקובטורים לזבוביםציודקיבולת לחות גבוהה (60-75%), טמפרטורה ניתנת לכיוונון, ומחזור אור:חושך של 12 שעות:12 שעות.
ספקטרומטר NMR מדגם Bruker Bio-Spin Avance (600.13 MHz) עם גשש תהודה משולשת (triple resonance) של 4 מ"מ (1H, 13ג', 2H) גשוש HRMAS ציודBruker Corporation
יחידת BTO-2000 בשילוב עם יחידה פנאומטית ל-MASציודBruker Corporation
רוטור זירקוניום אוקסיד 4 מ"מ (קיבול 50 מיקרוליטר)ציודBruker CorporationB3829 (חנות Bruker)
MestReC (Mestrelab Research) תוכנהניתוח ספקטרומי NMR חד-ממדיים (1D NMR)
http://mestrelab.com/
SPARKY 3, USCFתוכנהניתוח ספקטרוסקופיית NMR דו-ממדית
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

מקורות

  1. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
  2. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
  3. Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
  4. Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
  5. Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
  6. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
  7. Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MRS In VivoNMR
ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.