וידאו זה יהיה להדגים כיצד להשיג hemocytes (כדוריות דם) של הוואי bobtail דיונון, Euprymna scolopes לשימוש מבחני תא ביולוגי חיידקי הידבקות. Hemocytes יהיה מוכתם עם פלורסנט לצבוע וחשוף GFP שכותרתו חיידקים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קבלת Hemocytes מן הוואי Bobtail קלמארי Euprymna scolopes והתבוננות דבקותם חיידקים סימביוטיים שאינן הסימביוטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרים לגבי תפקידה של המערכת החיסונית בתיווך איתות מולקולרי בין חיידקים מועילים המארחים שלהם, בשנים האחרונות, תרומה משמעותית להבנת האבולוציה המשותפת של אאוקריוטים עם החיידקים שלהם. הקשר הסימביוטי בין הוואי bobtail דיונון,
פרוטוקול
- הכן 500 MLS של 0.22 פילטר מעוקרים ים מלאכותי מיקרומטר (FSW; מליחות 35 ppt). ים מלאכותי או טבעי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרון מיקרומטר להסיר חלקיקים וחיידקים.
- הרדימי אחד מבוגר הוואי bobtail דיונון (Euprymna scolopes) על ידי הצבת בפתרון 2% אתנול FSW. מניחים את החיה הרדמה למשך כ 10 דקות. דיונון תחדל שחייה לא יהיה פעיל להגיב למגע. הנשימה המשך, שמסומן על ידי התנועה של המעטפת, ופעילות chromatophore עדיין צריך להיות שנצפו.
- המקום דיונון עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה על מגש שעווה רגילה לנתיחה. להטביע את חיה עם FSW המכיל אתנול 2%.
- שימוש אחד רגיל 200 טיפים פיפטה μl, למשוך בחזרה את המשפך ואת המעטפת כדי לחשוף את כלי הדם הראשי cephalic ממוקם בין שתי העיניים.
- באמצעות מזרק סטרילי 1 מ"ל עם מחט 26.5-מד, לנקב את כלי הדם cephalic ולסגת בין 50-100 μl של hemolymph. מניחים את hemolymph בצינור סטרילי 1.5 מ"ל על הקרח.
הערה: אם חיה ישמש פעמים תורם רבות, רק לסגת 10-20 μl של hemolymph בכל זמן נתון. מחזירים את החיה טנק מי ים רגילים. חיה יהיה להחיות בתוך 30 דקות. - Hemocytes שנאספו טרי נשטפים מחדש תלויה μl 500 של פתרון קלמארי של Ringer (S-האצבעות; 530 mM NaCl, KCl 10 mM, 25 מ"מ MgCl 2, 10 mM CaCl 2 ו - 10 mM חיץ HEPES, pH 7.5).
- ריכוזים Hemocyte נקבעים על ידי hemocytometer, וכ 2,000 תאים מתווספים תלושי החדרים מכסה זכוכית, ואפשר לדבוק הזכוכית של 10 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה צפיפות, hemocytes הטופס monolayer אחיד על פני השטח את השקופית זכוכית.
- כדי לצפות חיידקי מחייב hemocytes המארח, hemocytes נחשפים זן חיידקי שכותרתו fluorescently כגון Vibrio fischeri ES114 ו / או Vibrio harveyi B392, שכל אחת מהן מכילה כתב פלואורסצנטי ירוק. V. fischeri ES114 וו ' harveyi B392 גדלים לשלב יומן אמצע ב tryptone מי ים מדיה (SWT) על 28 מעלות צלזיוס שייקר מסלולית. צפיפות אופטית ב 600nm נמדדת spectrophotometrically לקבוע צפיפות התאים. חיידקים הם pelleted ידי צנטריפוגה (5000 סל"ד במשך 5 דקות), supernatant הוא מושלך, ואת גלולה מחדש תלויה S-האצבעות.
- 100,000 תאים חיידקיים מתווספים קאמרית כל כך טוב כי יש 50 חיידקים לכל hemocyte בממוצע. Hemocyte / תערובות חיידקים מודגרת בפתרון של S-Ringer במהירות של 25 ° C עבור 1 שעה, זמן נקבע להניב את מרב מחייב.
- הציטופלסמה של hemocytes אז הם מוכתמים fluorescently עם CellTracker אורנג' 0.005% (Invitrogen) ולאחר מכן לשטוף S-האצבעות כדי להמחיש את התאים.
- Hemocytes ויטראז עם חיידקים הקשורים נתפסים על ידי הקרינה או באמצעות גילוי Zeiss stereoscope V20 פלורסנט או מיקרוסקופ SP2 לייקה לייזר ספקטרלי confocal, ומנה מעל פני השטח של התא החי.
נציג תוצאות
מכיוון hemolymph תכשיטים hemocyanin מכיל תאית ולא המוגלובין, על חמצון, hemolymph יהפוך לכחול כהה. הממוצע של ~ 5000 hemocytes לכל μl של hemolymph יושג באמצעות שיטה זו. לאחר עמידה מחליק לכסות החדרים ואת מכתים ניאון, hemocytes אמור להופיע במאור אדום fluorescently ו amoeboid בצורת. עבור הידבקות חיידקים, V. fischeri תדבק גרוע hemocytes (1-2 תאים חיידקיים לכל תא דם) תוך V. harveyi תדבק מאוד (10-15 תאים חיידקיים לכל hemocyte).
באיור 1. למבוגרים הוואי bobtail דיונון Euprymna scolopes מראה המיקום של כלי דם cephalic.
איור 2. תוצאות של חשיפה hemocyte כדי Vibrio fischeri (א) ו Vibrio harveyi (B). אדום, כתום Cell Tracker, ירוק, GFP שכותרתו חיידקים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים לגבי תפקידה של המערכת החיסונית בתיווך איתות מולקולרי בין חיידקים מועילים המארחים שלהם, בשנים האחרונות, תרומה משמעותית להבנת האבולוציה המשותפת של אאוקריוטים עם החיידקים שלהם. מערכת דיונון / Vibrio הוכיחה את עצמה כמערכת מודל ממושמע כדי לענות על שאלות היסוד בתחום זה 2,3,5,6,8. אור איבר של Euprymna דיונון scolopes היתרי קולוניזציה באופן בלעדי על ידי החיידק המאיר Vibrio fischeri. מאחר ורקמות שהבית חיידקים נשארים במגע עם מי ים, דיונון צריך לא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
מקורות המימון: אוניברסיטת קונטיקט קרן המחקר והמחלקה לביולוגיה מולקולרית Cell ל SVN, Sigma Xi גרנט-in-Aid-מחקר אנטוניו ח ו ר Majorie
רומנו בוגר חינוך לידידות AJC
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת כיסויי זכוכית בורוסיליקט עם תאים Lab-Tek #1.0 (8 תאים) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 155411 | |
| מזרק אינסולין ללא לטקס 1ml, 26.5 G | BD Biosciences | C34551 | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen | C34551 | |
| מיקרוסקופ SteREO Discovery V20 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| מיקרוסקופ קונפוקאלי SP2 | Leica Microsystems |
מקורות
- Koropatnick, T. A., Kimbell, J. R., McFall-Ngai, M. J. Responses of host hemocytes during the initiation of the squid-Vibrio symbiosis. Biol. Bull. 212, 29-39 (2007).
- McFall-Ngai, M. J. Unseen forces: the influence of bacteria on animal development. Dev. Biol. 242, 1-14 (2002).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Nyholm, S. V., Stewart, J. J., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Recognition between symbiotic Vibrio fischeri and the haemocytes of Euprymna scolopes. Environ. Microbiol. 11, 483-493 (2009).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Nyholm, S. V., Stabb, E. V., Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. Establishment of an animal-bacterial association: recruiting symbiotic Vibrios from the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 10231-10235 (2000).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. Sampling the light-organ microenvironment of Euprymna scolopes: description of a population of host cells in association with the bacterial symbiont Vibrio fischeri. Biol Bull. 195, 89-97 (1998).
- Visick, K. L., Ruby, E. G. Vibrio fischeri and its host: it takes two to tango. Curr. Opin. Microbiol. 9, 632-638 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
