השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

סיכום

המטרה של המצגת היא להדגים שיטה לשחזור מאוד ליצור מטריצה ​​תא הקשורים שתלים גזע פגמים הסחוס, אשר יכול להיות דמיינו עם MR הדמיה. בתאי גזע מסומנים עם ה-FDA Ferumoxides, מעורבב עם agarose, מושתלים לתוך פגמים סחוס צילמו עם סורק 7T MR.

תקציר

תחום הנדסת הרקמות משלבת את עקרונות הביולוגיה, ההנדסה והרפואה תא לקראת התחדשות של תאים ספציפיים רקמות תפקודית. מטריקס תאים הקשורים גזע שתלים (מאסי) במטרה לחדש פגמים הסחוס עקב פציעות משותף דלקת פרקים או טראומטי. למבוגרים בתאי גזע mesenchymal (MSCs) יש את היכולת להתמיין לתאי השושלת chondrogenic ו הראו תוצאות מבטיחות עבור התא מבוססי טכנולוגיות הסחוס במפרק לתקן. עצמיים MSCs יכול להיות מבודד במגוון של רקמות, ניתן להרחיב בתרביות תאים מבלי לאבד פוטנציאל הבידול שלהם, הדגימו בידול chondrogenic במבחנה ^{1 vivo, 2.}

כדי לספק שמירה מקומיים הכדאיות של MSCs המושתלים פגמים סחוס, פיגום יש צורך, התומך גם בידול התפשטות עתידיים. הארכיטקטורה של היווצרות רקמה פיגום מדריכים מאפשר תאי מטריקס, המיוצר על ידי בתאי גזע, להרחיב. תחקירים קודמים הראו כי 2% agarose פיגום עשוי לתמוך בפיתוח של הסחוס hyaline יציב ואינו לגרום התגובה החיסונית ^3.

שימור ארוך טווח של בתאי גזע מושתלים מאסי הוא קריטי עבור התחדשות הסחוס. תיוג של MSCs תחמוצת ברזל עם חלקיקים מאפשר לטווח ארוך מעקב vivo עם פולשנית טכניקות הדמיה MR ^4.

מצגת זו תדגים טכניקות MSCs תיוג עם חלקיקי תחמוצת ברזל, הדור של תאים agarose בונה ההשתלה של מבנים אלה לתוך פגמים הסחוס. בונה שכותרתה ניתן לעקוב הלא פולשני עם MR-Imaging.

פרוטוקול

1. תיוג של hMSCs עם Endorem

1. התאים גדלים על מפגש 80% לפחות 18 שעות לפני תיוג.
2. במהלך תקופה זו, התקשורת תיוג מוכן ידי הוספת Endorem המדגם במינון של 100 UG Fe / מ"ל ​​סרום ללא התקשורת.
3. אחרי התאים גדלים על מפגש, תרבות מדיה aspirated תאים נשטפים 1x עם PBS או סרום ללא התקשורת.
4. בשלב הבא, הפתרון הוא לשטוף aspirated והתקשורת תיוג מוכן בעבר הוא הוסיף. התאים מודגרת אז 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 4 שעות.
5. לאחר דגירה 4 שעות, תיוג מדיה aspirated ותאי הם שטופים עם PBS ו trypsinized כרגיל.
6. Trypsinized פעם, תאים נשטפים 3x עם PBS ו centrifuged ב 400rcf במשך 5 דקות.
7. לאחר שלב זה כביסה, תאים resuspended, נספר, העריכו את הכדאיות, ושימש הדרושים לניסויים.

2. הכנת agarose

1. אחרי התאים סומנו בתווית זה הזמן להכין את הפתרון agarose.
2. בסולם בסדר, 80mg של agarose אבקת הם שקלו להוסיף 2ml של PBS.
3. פתרון זה אז מזועזע בעדינות autoclaved.
4. לאחר כ 40 דקות, הפתרון נוזל agarose ניתן לקחת מתוך החיטוי. היקף צריכה להיות מדודה מותאמים בהתאם עם PBS שחומם מראש.
5. אז הפתרון הוא מקורר עד 42 ° C

3. יצירת מאסי

1. כאשר הפתרון agarose הגיעה הטמפרטורה הרצויה, התאים נספרים ו centrifuged בפעם האחרונה בצינור 1.5ml Eppendorf.
2. לאחר צנטריפוגה, supernatant הוא מושלך לבין התאים מעורבבים עם DMEM להגיע ריכוז של 30 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
3. עכשיו התאים מעורבבים עם 42 ° C agarose חם.
4. טיפ פיפטה קר עלול לגרום agarose לגבש בתוך קצה, ולכן מומלץ קצה מחממים ידי pipetting חם סטרילי PBS למעלה ולמטה
5. עכשיו, באותו נפח של agarose כמו התקשורת נלקח למעלה מעורב באופן יסודי עם ההשעיה התא מדיה כך השעיה אחיד נוצרת.
6. שמור את הצינור Eppendorf בתוך אמבט מים שחומם מראש תוך ערבוב כך agarose אינו להתקרר מספיק כדי לחזק.
7. כאשר ההשעיה היא הומוגנית, התאים המושתלים הפגם.

באיור 1. העטרה תמונות T2 משוקלל SE (TR 4000 ms / TE 18.27 ms) של דגימה פיקת הברך עם hMSCs מושתל פגמים הסחוס.

דיון

פרוטוקול תיאר מספק דרך לשחזור לתייג MSCs חלקיקי תחמוצת ברזל עם השתל ואת אלה MSCs שכותרתו לתוך פגמים הסחוס. טכניקה זו מאפשרת לא פולשנית תיאור של השתלת תא גזע פגמים סחוס עם MR הדמיה, המאפשרת גילוי מוקדם של כשל מאסי. נקע או בזרימת של תאים שכותרתו ניתן לאבחן מבוסס על היעלמותה של התווית מהאתר השתלת על תמונות MR. אבחון מוקדם של אירועים אלו רצוי היה למנוע את החולה חלופה הליכים מיותרים אבחון פולשניות. תיאר שיטה לא פולשנית לאבחון תוצאות מאסי, יכול לסייע בפיתוח מוצלח של טיפולים מבוססי תאים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
D-MEM עם ריכוז גבוה של גלוקוז	ריאגנט	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (ללא סידן ומגנזיום)++, מגנזיום++ חינמי		GIBCO, מבית Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%		Invitrogen	25399-120
סרום עגל רבוי (FBS)		Hyclone	SH30071.03
פניצילין/סטרפטומייצין		GIBCO, מבית Life Technologies	15140-122
פרומוקסידים (Endorem)		Guerbet
אגרוז מסוג VII		Sigma-Aldrich	A9045	דלל אגרוז ב-PBS לריכוז סופי של 4%