אמא הוא חלבון ייחודי הקשור Magnetosome אשר הוצגה להיות מעורב ההפעלה magnetosome. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור של אמא המחיקה מוטציה (MamAΔ41) מ מ magneticum השגריר-1.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41
במאמר זה
סיכום
תקציר
חיידקים Magnetotactic מהווים קבוצה מגוונת של מיקרואורגניזמים ימיים המסוגלים להתמצא עצמם לאורך שדות geomagnetic. התנהגות זו הוא האמין סיוע בחיפוש אחר בסביבה מתאימה
פרוטוקול
1. שיבוט וביטוי של אמא ג'ין ב E. coli
הגן המוטנטי mamAΔ41 היה מוגבר באמצעות שרשרת התגובה פולימראז (PCR) של הדנ"א הגנומי של Magnetospirillum magneticum השגריר-1, עם primers: 5'-3-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG 'ו 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3 ". בשנת שברי דנ"א מוגבר, אתר NcoI הוצג בבית קודון התחלת ATG ואת קודון סיום הוחלף באתר ScoI. שברי היו מתעכל עם NcoI ו SacI ו משובטים לתוך האתרים השונים של pET52b (+), והוליד pET52bMamAΔ41-AMB1. ב לבנות זו, הגן mamAΔ41 היה התמזגו בתוך מסגרת עם תג-10 שלו בתחנה הסופית-C. הפלסמיד היה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
טיהור חלבון היא הצעד העיקרי כל החלבונים או הביוכימיות מחקרים מבניים. מאז החלבון הוא ייחודי עם ההתנהגות שלו, צריך להגדיר את המאפיינים שלו ולשנות טיהור שלה בהתאם. היעד חלבון יש לנתח כצעד ראשון לקראת טיהור שימוש בכלים לביואינפורמטיקה. הם משמשים כדי לחשב את נקודת iso חשמלי יעד, להעריך את הצורך שלה עבור הפחתת / חמצון הסביבה ועל הצורך שלה עבור יונים / ligands מיוחד. ישנם מספר שינויים קריטיים של פרוטוקול שלנו אשר משקפים את הייחודיות היעד. שינויים אלה כוללים, חיץ טמפרטורות עבודה והתאמות ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מכירים ד"ר אמיר אהרוני על תמיכתו וגאולה דוידוב, נועם גרימברג חן גוטמן עצה והערותיהם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| French Press | ציוד | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-078A | |
| תא לחץ | ציוד | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 | |
| אולטרה-צנטריפוגה | ציוד | Sorvall, Thermo Scientific | Discovery 90SE | |
| רוטור | ציוד | Beckman Coulter Inc. | Ti60 | |
| מבחנות לאולטרה-צנטריפוגה; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | ציוד | Beckman Coulter Inc. | BC-355618 | |
| עמודי כרומטוגרפיה מסוג Glass Econo-Column, קוטר 2.5cm | ציוד | Bio-Rad | 737-2521 | |
| שרף Ni-NTA His Bind | ציוד | Novagen, EMD Millipore | M0063428 | |
| ספקטרופוטומטר | ציוד | Amersham | Ultraspec 2100 pro | |
| קובית קוורץ | ציוד | Hellma | 104-QS | |
| כרומטוגרפיית נוזלים מהירה (FPLC) - AKTA purifier 10 | ציוד | GE Healthcare | 28-4062-64 | |
| עמוד חילוף יונים – MonoQ 4.6/100 PE | ציוד | GE Healthcare | 10025543 | |
| עמוד מילוי מראש להפרדה לפי גודל (Size exclusion) - HiLoad 26/60 Superdex 200 | ציוד | GE Healthcare | 17-1071-01 | |
| Centricon - Vivaspin15 – 10,000 MWCO | ציוד | Sartorius AG | VS1501 | |
| צנטריפוגת שולחן | ציוד | Thermo Fisher Scientific, Inc. | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | ציוד | Bruker Corporation | Reflex IV | |
| Tris-HCl ((hydrotymethyl) aminomethane) | ריאגנט | BioLab | 20092391 | |
| נתרן כלוריד | ריאגנט | FRUTROM | 235553470 | |
| אימידזול | ריאגנט | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| תערובת מעכבי פרוטאז ללא EDTA | ריאגנט | Sigma-Aldrich | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | ריאגנט | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | ריאגנט | Fisher Scientific | BP25432 | |
| גליצין | ריאגנט | BioLab | 07132391 | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | ריאגנט | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercapto–thanol | ריאגנט | Sigma-Aldrich | M-3148 | |
| InstantBlue | ריאגנט | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ריאגנט | Fermentas | SM0671 |
מקורות
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes. Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).
- D'Andrea, L. D., Regan, L. TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).
- Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
