וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו, בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, מסתעפת, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי בתוך מבחני לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. בהתבסס על עבודה קודמת על ידי Nehls ו Drenckhahn, יש לנו אופטימיזציה ב assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, חשוב, כלי התצוגה לומן אינטר פטנט מוקף EC מקוטב. EC הם מצופים על microcarriers cytodex ומוטבעים לתוך ג'ל הפיברין. Fibroblasts הם שכבות על גבי ג'ל שבו הם מספקים גורמים מסיסים הכרחי לקדם EC הנבטה מפני השטח של החרוזים. אחרי כמה ימים, כלי רבים נוכחים כי ניתן בקלות לצפות תחת ניגוד פאזה זמן לשגות מיקרוסקופ. וידאו זה מדגים את השלבים העיקריים בהקמת אלה תרבויות.
פרוטוקול
הכנות CELLS
- תביאו את HUVEC ו fibroblasts ב% M199/10 FBS / עט סטרפטוקוקוס (1:100) 1-2 ימים לפני ואגלי.
- החלף בינוני עד EGM-2 (Clonetics) יום לפני ואגלי עבור HUVEC ויום לפני הטבעה עבור fibroblasts.
- ריכוז של ~ 400 HUVEC לכל חרוז יש צורך.
- 20,000 fibroblasts היטב לכל צורך.
ציפוי החרוזים עם HUVEC - -1 יום
- Trypsinize HUVEC.
- אפשר להסתפק חרוזים (אינם צנטריפוגות!). לשאוב supernatant ולשטוף את החרוזים בקצרה 1 מ"ל של מדיום EGM-2 חמים.
- 2500 חרוזים Mix w / 1x10 6 HUVEC ב 1.5 מ"ל של מדיום EGM-2 חם צינור FACS. המקום אותו במאונך בחממה. (זה יהיה מספיק ~ 10 בארות. הסולם במידת הצורך)
- דגירה במשך 4 שעות ב 37 ° C, מטלטלת את הצינור כל 20 דקות. (ציפוי טוב הוא קריטי עבור נביטה).
- לאחר 4 שעות, להעביר את החרוזים מצופים על בקבוק T25 ב 5 מ"ל של EGM-2 ו לעזוב O / נ
הטבעה חרוזי מצופה הפיברין GEL - יום: 0
- הכן את הפתרון מ"ג / מ"ל 2.0 פיברינוגן (ראה סעיף מתכון).
- הוסף 0.15 יחידות / מ"ל של aprotinin לפתרון פיברינוגן.
- העברת חרוזים מצופים אל צינור חרוטי 15ml ולתת חרוזים להתיישב. חרוזים Resuspend ב 1mL של EGM-2 ו להעביר צינור צנטריפוגות 1.5mL.
- שטפו את החרוזים 3X עם 1mL של EGM-2 על ידי pipeting לאט מלמעלה למטה.
- ספירת חרוזים על coverslip ו resuspend בפתרון פיברינוגן בריכוז של ~ 500 חרוזים / mL.
- הוסף 0.625 יחידות / מ"ל של תרומבין היטב כל אחד.
- הוסף 0.5 מ"ל של פיברינוגן השעיה / חרוז היטב בכל צלחת 24 באר.
שנה את קצה פיפטה עבור כל טוב! - מערבבים את תרומבין ואת פיברינוגן על ידי עולה ויורדת בעדינות עם קצה פיפטה ~ 4 עד 5 פעמים. תיזהר לא לעשות בועות גדולות.
- השאירו את צלחת 5 דקות בשכונה, ואז למקם אותו על 37 ° C-חממה 10-15 דקות כדי ליצור קריש דם.
- בזמן ההמתנה הקריש, trypsinize fibroblasts.
- הוסף 1 מ"ל של EGM-2 לכל גם טיפה חכם.
- זרעים fibroblasts על גבי הפיברין ג'ל בריכוז של 20,000 תאים לכל טוב.
הערות:
בדרך כלל, כאשר קריש הפיברין נוצר, תראה בועות קטנטנות בתוך הג'ל. אל תדאג, הם ייעלמו בתוך 3-4 ימים.
שנה את התקשורת בכל יום אחר, כלומר, יום 2, 4, 6, וכו '..
ביום 3 או 4 אתה צריך להתחיל לראות נביטה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קיימת הסכמה גוברת תלת ממדי (3D) ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה להציע מודל אשר הרבה יותר לסביבה מאשר בפועל in vivo יכולה להיות מושגת באמצעות תרבויות 2D. ניכר כי מערכות 3D מעולה צריך להיות לשחזור, ולהיות מסוגלים לחקות כמה שלבים עיקריים של אנגיוגנזה. בעוד מספר מבחני 3D הקודם פותחו, רבים מהם גם להשתמש שקשה להשיג תאים כלי הדם, או לשחזר רק חלק מהשלבים. בסרטון הזה, אנו מתארים ולבצע אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC, אשר להשגה בקלות ואת EC הנפוץ ביותר במחקר וסקולרית. Assay, במשך מספר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| חרוזי Cytodex-3 | ריאגנט | Amersham | 17-0485-01 | 10 g לבקבוק. 1.0.5 g של חרוזים יבשים עוברים הידרציה ונפיחות ב-50 mL PBS (pH = 7.4) למשך 3 h לפחות ב-RT. השתמש במבחנה של 50 mL והנח אותה על רוקר (rocker). 2. הנח לחרוזים לשקוע (~ 15 min). השלך את supernatant ושטוף את החרוזים למשך מספר דקות ב-PBS טרי (50 mL). 3. השלך את ה-PBS והחלף ב-PBS טרי: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL או 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL. 4. העבר את תרחיף החרוזים לבקבוק זכוכית סיליקוני (Windshield Wiper או Sigmacote). 5. סטרilize את החרוזים באמצעות אוטוקלאב למשך 15 min ב-115°C. 6. אחסן ב-4°C. |
| Aprotinin | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg לבקבוק. המס aprotinin ליופילז בריכוז 4 U/mL במים מזוקקים (DI water). סינון סטרילי. הכן אליקוטות של 1 mL כל אחת. אחסן ב- -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | ריאגנט | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. המס 2 mg/mL fibrinogen ב-DPBS. שים לב לאחוז החלבון הניתן לקרישה (clottable protein %) והתאם בהתאם. חמם באמבט מים של 37 °C כדי להמיס את ה-fibrinogen. ערבב על ידי הפיכת המבחנה. אין להשתמש ב-vortex. סינון סטרילי דרך 0.22 um. |
| Thrombin | ריאגנט | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. המס במים סטריליים בריכוז 50 U/mL. הכן אליקוטות של 0.5 mL כל אחת. אחסן ב- -20 °C. |
מקורות
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
