וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו, בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, מסתעפת, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי בתוך מבחני לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. בהתבסס על עבודה קודמת על ידי Nehls ו Drenckhahn, יש לנו אופטימיזציה ב assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, חשוב, כלי התצוגה לומן אינטר פטנט מוקף EC מקוטב. EC הם מצופים על microcarriers cytodex ומוטבעים לתוך ג'ל הפיברין. Fibroblasts הם שכבות על גבי ג'ל שבו הם מספקים גורמים מסיסים הכרחי לקדם EC הנבטה מפני השטח של החרוזים. אחרי כמה ימים, כלי רבים נוכחים כי ניתן בקלות לצפות תחת ניגוד פאזה זמן לשגות מיקרוסקופ. וידאו זה מדגים את השלבים העיקריים בהקמת אלה תרבויות.
פרוטוקול
הכנות CELLS
- תביאו את HUVEC ו fibroblasts ב% M199/10 FBS / עט סטרפטוקוקוס (1:100) 1-2 ימים לפני ואגלי.
- החלף בינוני עד EGM-2 (Clonetics) יום לפני ואגלי עבור HUVEC ויום לפני הטבעה עבור fibroblasts.
- ריכוז של ~ 400 HUVEC לכל חרוז יש צורך.
- 20,000 fibroblasts היטב לכל צורך.
ציפוי החרוזים עם HUVEC - -1 יום
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
קיימת הסכמה גוברת תלת ממדי (3D) ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה להציע מודל אשר הרבה יותר לסביבה מאשר בפועל in vivo יכולה להיות מושגת באמצעות תרבויות 2D. ניכר כי מערכות 3D מעולה צריך להיות לשחזור, ולהיות מסוגלים לחקות כמה שלבים עיקריים של אנגיוגנזה. בעוד מספר מבחני 3D הקודם פותחו, רבים מהם גם להשתמש שקשה להשיג תאים כלי הדם, או לשחזר רק חלק מהשלבים. בסרטון הזה, אנו מתארים ולבצע אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC, אשר להשגה בקלות ואת EC הנפוץ ביותר במחקר וסקולרית. Assay, במשך מספר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| חרוזי Cytodex-3 | ריאגנט | Amersham | 17-0485-01 | 10 g לבקבוק. 1.0.5 g של חרוזים יבשים עוברים הידרציה ונפיחות ב-50 mL PBS (pH = 7.4) למשך 3 h לפחות ב-RT. השתמש במבחנה של 50 mL והנח אותה על רוקר (rocker). 2. הנח לחרוזים לשקוע (~ 15 min). השלך את supernatant ושטוף את החרוזים למשך מספר דקות ב-PBS טרי (50 mL). 3. השלך את ה-PBS והחלף ב-PBS טרי: 25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL או 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL. 4. העבר את תרחיף החרוזים לבקבוק זכוכית סיליקוני (Windshield Wiper או Sigmacote). 5. סטרilize את החרוזים באמצעות אוטוקלאב למשך 15 min ב-115°C. 6. אחסן ב-4°C. |
| Aprotinin | ריאגנט | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg לבקבוק. המס aprotinin ליופילז בריכוז 4 U/mL במים מזוקקים (DI water). סינון סטרילי. הכן אליקוטות של 1 mL כל אחת. אחסן ב- -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | ריאגנט | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. המס 2 mg/mL fibrinogen ב-DPBS. שים לב לאחוז החלבון הניתן לקרישה (clottable protein %) והתאם בהתאם. חמם באמבט מים של 37 °C כדי להמיס את ה-fibrinogen. ערבב על ידי הפיכת המבחנה. אין להשתמש ב-vortex. סינון סטרילי דרך 0.22 um. |
| Thrombin | ריאגנט | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. המס במים סטריליים בריכוז 50 U/mL. הכן אליקוטות של 0.5 mL כל אחת. אחסן ב- -20 °C. |
מקורות
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
