Method Article

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

DOI:

10.3791/1863

⸱

March 24th, 2010

 ,  , 
1Department of Biological Sciences and Purdue Center for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

א התרבות תאים אינדוקציה חלבון

סעיף זה מתאר תרבית תאים התנאים, מחזור התא סנכרון עם Nocodazole, ואחריו אינדוקציה של ביטוי חלבון מן מקדם regulatable בתאי שמרים.

  1. סוג בר שמרים זן W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) הופך עם העתק גבוהה (2μ) DNA פלסמיד המכיל את הגן שלנו עניין (ENTH2) תחת שליטה האמרגן של מתיונין-repressible (MET25). 2mm מתיונין מספיקה כדי לדכא את פעילות הפרומוטר, בעוד התקשורת חסר מתיונין מאפשר ביטוי מקסימלי. לפיכך, בטווח....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח על התפתחות פנוטיפ מורפולוגיים (תא שמרים מסוגלים לעבור חלוקת התא הנכון) על overexpression חלבון. כאשר עושים את זה הליך חשוב לזכור לקצור תאים שמרים ידי pelleting במהירות צנטריפוגה מומלץ מהירויות גבוהות עלולה לגרום נזק לתאים תוצאות מעורפלות. מתילן כחול Calcofluor לבן יש להוסיף לחיות התאים בדיוק לפני הדמיה כפי שהם רעילים. הליך זה יכול גם להיות מותאם בקלות פנוטיפים נצפתה בתנאי דיכוי חלבון, ובלבד היעד מתבטאת מן מקדם לשליטה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בריאן ג'קון וקלאודיה ב חנה לדיונים מועיל ותמיכה. פרויקט זה מומן על ידי סטארט כספים מח'. של מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue ר קלאודיו אגילר לבין האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מענק מחקר ר קלאודיו אגילר באמצעות מרכז Purdue סרטן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מגיב NocodazoleSigma-AldrichM1404
מתילן כחול 1% (w/v)מגיבVWR בינלאומיVW6276-0
Calcofluor מגיב לבןסיגמא-אולדריץ'F3543
מגיב ג'לי נפטVWR בינלאומיVW3339-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rönicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).
  2. Gietz, R. D., Woods, R. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein ConcentrationMorphological PhenotypeBudding YeastWestern BlottingMicroscopy AnalysisTime Lapse VideoSeptin MislocalizationCell Division DefectMethionine Repressible PromoterAgrose Bed Preparation

Related Articles