הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

סיכום

תכונה אחת של מחלת אלצהיימר היא העלאת Aβ _1-42 פפטיד. כאן אנו מספקים פרוטוקול להכנת Aβ סינתטי _1-42 Oligomers, אשר פוגע בהיפוקמפוס potentiation לטווח ארוך, הסלולר לתאם של זיכרון. הליך זה שימושי לחקר מנגנוני סינון פתולוגיה התרופה Aβ-Induced.

תקציר

ירידת ערך של קשרים סינפטיים צפוי בבסיס השינויים בשכחה עדין המתרחשים בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר (AD). β עמילואיד (Aβ), פפטיד המיוצר בכמויות גבוהות לספירה, ידוע להפחית הגברה לטווח ארוך (LTP), הסלולר לתאם של למידה וזיכרון. אכן, פגיעה הנגרמת על ידי LTP Aβ היא פרדיגמה ניסויית שימושי לחקר תפקוד סינפטי במודלים לספירה עבור תרופות ההקרנה מסוגל מקלים או מביטול ליקויי הסינפטי כאלה. מחקרים הראו כי Aβ מייצרת את שיבוש LTP מועדף באמצעות טופס oligomeric שלה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור LTP פגיעה על ידי טפטוף של oligomerized סינתטי Aβ1-42 פפטיד על פרוסות בהיפוקמפוס חריפה. בסרטון זה, אנו המתאר הליך צעד אחר צעד להכנת Aβ oligomeric

פרוטוקול

Resuspending β עמילואיד פפטיד

לפני תחילת העבודה יש ​​להכין:

• Aβ _1-42 (אבקת lyophilized)
• 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
• נמוך מחייב microcentrifuge צינורות פוליפרופילן (1.5 מ"ל)
• GasTight המילטון מזרק עם להפסיק לצלול טפלון (250 μl)
• Dimethylsulfoxide (DMSO)

1. אפשר Aβ lyophilized _1-42 לאזן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי למנוע התעבות עם פתיחת הבקבוקון פפטיד.
2. מתחת למכסה המנוע קטר, מחדש להשעות Aβ _1-42 פפטיד HFIP קרים כדי להשיג פתרון 1 מ"מ המערבולת פתרון לכמה שניות.
3. באמצעות מזרק זכוכית GasTight המילטון עם תוסף טפלון, במהירות לחלק את הפתרון Aβ _1-42 / HFIP שווה לשלוש מבחנות פוליפרופילן לאטום את צלוחיות.
4. צלוחיות מודגרת אז עבור 2 שעות על מנת לאפשר monomerization Aβ. לאחר מכן, לפתוח את צלוחיות להתרכז הפתרון _1-42 / HFIP Aβ תחת ואקום באמצעות צנטריפוגות SpeedVac (800 גרם, בטמפרטורת החדר) עד סרט פפטיד ברור הוא ציין בתחתית צלוחיות. בדוק היטב את הטמפרטורה בתוך בצנטריפוגה SpeedVac כדי למנוע השפלה פפטיד (מקסימום 25 ° C).
5. החותם צלוחיות בחנות aliquots ב -80 ° C. הסרט Aβ יכול להיות מאוחסן במשך 6 חודשים.
6. Re-להשעות סרט אחד על ידי הוספת DMSO לקבל ריכוז של עד 5 מ"מ Aβ _1-42. Sonicate באמבט מים במשך 10 דקות על מנת להבטיח להשלים מחדש ההשעיה.
7. זה Aβ 5mm Aliquot _1-42 פתרון לתוך צלוחיות פוליפרופילן. חותם את כל בקבוקוני ולאחסן אותם ב -20 ° C. Aliquots צריך להיות מופשר רק פעם אחת. היזהרו עיבוי מים בתוך המקפיא. פפטידים בתמיסה לבזות בקלות רבה.

Oligomerization

לפני תחילת העבודה יש ​​להכין:

• Aβ _1-42 / DMSO (5mm)
• פוספט סטרילי חיץ
• נמוך מחייב microcentrifuge צינורות פוליפרופילן (1.5 מ"ל)
• נמוך מחייב צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן (50 מ"ל)

1. לדלל את Aβ 5mm לקבל _1-42 / aliquot DMSO עם חיץ סטרילי פוספט (עד 100 μl).
2. וורטקס למשך 30 שניות ואז דגירה של 12 שעות 4 ° C

פרוסה בהיפוקמפוס טיפול

כאשר מטפלים פרוסות בהיפוקמפוס, חשוב להימנע הלא ספציפית פפטיד הדבקה על כוסות, משטחים צינורות טפטוף, ואת חדר ההקלטה. השתמש מעדיפים נמוך מחייב צינורות פוליפרופילן מכולות. יש להימנע משימוש של כלי זכוכית או פלסטיק, כלי גנרי. התקשורת צריכה להיות זלוף בסרום או אלבומין חינם.

Aβ זלוף

לפני תחילת העבודה יש ​​להכין:

• Oligomerized Aβ _1-42
• חיץ הקלטה (במ"מ: 124 NaCl, KCl 4.4, 1 Na ₂ HPO _4, 25 NaHCO _3, 2 CaCl _2, 2 MgCl _2, 10 גלוקוז)
• הקלטה אלקטרו הגדרת ממשק עם תא
• פרוסות בהיפוקמפוס רוחבי מודגרות במאגר הקלטה מחומצן במשך לפחות 90 דקות לאחר דיסקציה (ט = 29 ° C; זלוף שיעור קבוע = 2 מ"ל / דקה)

1. מיד לפני הניסוי, לדלל את aliquot _1-42 oligomerized Aβ לריכוז עבודה מתאימה (200 ננומטר ומעלה) בתוך צינור פוליפרופילן עם חיץ מראש מחומצן ההקלטה.
2. Perfuse הפתרון Aβ _1-42 במשך 20 דקות את פרוסות לפני הגיוס של הפלסטיות הסינפטית.

אינדוקציה של הפלסטיות ומעקב

1. בדרך כלל, המודל הנפוץ ביותר בשימוש של הפלסטיות הסינפטית הוא LTP. זה יכול להיגרם על ידי גירוי של סינפסה tetanic נתון בהיפוקמפוס. אנו רושמים תגובות השדה סינפסות בין התחזיות בטחונות של שפר ו CA1 עצב פירמידליים ב radiatum בשכבה. גירוי tetanic שלנו מורכב גירוי פרץ תטא הכולל 3 רכבות מופרדות 15 מרווחי השני. כל רכבת מורכב על 10 התפרצויות הרץ 5 שבו פרץ כל המשתמע מכך 5 פעימות ב 100 הרץ. החל את הגירוי tetanic מיד לאחר זלוף של Aβ oligomerized הושלמה.
2. מיד לאחר גירוי tetanic לחזור זלוף עם חיץ הקלטה רגילה. שמרו על קצב טפטוף קבוע, טמפרטורת חדר הקלטה חמצון תקין לאורך כל תקופת הניסוי.

תוצאות ייצוגית בעיות אפשריות

Aβ oligomerized לפי הפרוטוקול הקלאסי של Stine et קול. ^1, מייצר מונומרים Aβ ועוד מגוון של oligomers גודל שונהs (דימר, trimer, וכו ') זלוף של oligomerized Aβ _1-42 מוביל LTP ירד Aβ שטופלו פרוסות פרוסות לעומת שליטה. תחת תנאי הניסוי שלנו, איפה ישנים 3-5 חודש C57BL/6J עכברים זכרים רגילים, LTP ב 200 ננומטר Aβ שטופלו פרוסות על 150% הממוצע של ערכי הבסיס על שעתיים לאחר גירוי tetanic, בעוד פרוסות לשלוט ערכים הם LTP על ממוצע של 200-250% baseline2. במקרים מסוימים, הטיפול עלול להיכשל Aβ להפחית LTP בהיפוקמפוס. כמה טעויות קריטיות שעלולות להתרחש כוללים הסרט מופרז במהלך הייבוש ריכוז Aβ ו oligomerization שלם. זלוף Aβ בפרוסות ההיפוקמפוס עשוי להיות עוד מקור לדאגה בגלל המאפיינים physicochemical של הפפטיד Aβ פתרון, אשר נוטה הידבקות הלא ספציפית כדי פלסטיק. פתרון של בעיות אלה נדון להלן.

דיון

כפי שתואר לעיל, מספר בעיות בהכנת Aβ oligomeric עלול לגרום LTP נפגמה. אחת הדרכים להעריך אם Aβ השפלה או חוסר oligomerization Aβ ייתכן שאירעו היא להעריך את הכנת Aβ באמצעות טריס-PAGE Tricine / ניתוח סופג המערבי ultracentrifugation אנליטית (לא תיארו בפרוטוקול זה). כאשר דגימות סופג המערבי מוכנים בתנאים non-denaturing/non-reducing, הכנה מוצלחת יש ליצור חתימה סופג המערבי בהשתתפות להקות המתאים מונומרים ו oligomers שונה ^3. סוגיה המתרחשים לעתים קרובות הוא חוסר יציבות פפטיד במהלך ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Aβ 1-42 (ליופיליזציה)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
מבחנות צנטריפוגה מפוליפרופילן 50mL	Corning	05-538-67
מיקרו-מבחנות MaxyClear 1.5ml לשחזור מקסימלי	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Invitrogen	10010-023
מזרקי GASTIGHT 250 μL	Hamilton Co	1725
מכשיר סוניקציה (Bath sonicator)	Branson	3510
מערכת ריכוז Savant SpeedVac	Various	SC 110A