מאמר שיטה

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

DOI:

10.3791/1935

⸱

13 ביוני 2010

 ,  ,  , 
1Department of Physical Electronics, Faculty of Engineering, Tel Aviv University, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, University of Illinois, 4Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת מגנטית אפנון biosensing מנוצל במהירות, ברגישות פשוט לזהות מבחני ביולוגיים, כגון מולקולות דנ"א וחלבונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפנון מגנטי biosensing המערכת (MMB) [1,2] במהירות מטרות ביולוגיים זוהה הומוגנית בריכוזים נמוכים ללא כביסה או צעד ההפרדה. כאשר IL-8 היעד היה נוכח, "sandwich' מבוססי assay מצורף חרוזים מגנטיים עם נוגדן IL-8 ללכוד streptavidin חלבון פלואורסצנטי יחד דרך היעד IL-8 ו-IL-8 biotinylated נוגדן. החרוזים המגנטי תמרן לתוך תנועה oscillatory על ידי יישום הדרגתי לסירוגין השדה המגנטי דרך שני קטבים אלקטרומגנטיים. חלבונים פלורסנט, אשר מחוברים חרוזים מגנטיים מרוכזים לאזור איתור תנועתם פנימה והחוצה של קרן הלייזר אורתוגונליים מייצר אות ניאון תקופתי זה demodulated באמצעות גילוי סינכרוני. המערכת מגנטי biosensing אפנון ששימש בעבר לזהות את רצפי קידוד של החלבון Ibaraki הלא מבניים וירוס 3 (ns3) דנ"א משלים (cDNA) [2]. טכניקות כי הם הפגינו בעבודה זו מניפולציה התעבות חיצונית של חלקיקים עשויים לשמש ליישומים אחרים, כגון משלוח של תרופות מגנטית מצמידים

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IL-8 assay:

  1. תערובת התגובה כללה את ארבעת המרכיבים הבאים בנפח 100 μl הסופי של המאגר assay בריכוזים שלהם. 10 μl של חרוזים מגנטיים עם נוגדן ללכוד ב 100 חרוזים / ריכוזי הסופי μl, 2 μl של IL-8 biotinylated נוגדן בריכוז 1 הסופי nano-gram/μl, 1 μl של חלבון פלואורסצנטי streptavidin בריכוז 20 סופי nano-gram/μl, ו 1 μl של יעד IL-8 ב pico-gram/μl 0.48. הרכיבים מתווספים אחד אחד למאגר assay הם מזועזעים אז במשך 30 דקות.
  2. תגובה פקד מוכן באותה דרך ללא מטרה IL-8.
  3. התגובות ממוקמות מאוחר יותר ללא הפרדה או צעד כביסה cuvettes ובחן באמצעות מערכת MMB.

MMB המערכת:

  1. מניחים את קובט בעמדה שלו בין שני קטבים אלקטרומגנטיים.
  2. Operate הנוכחית אפנון ולחכות 30 שניות כדי לאפשר צבירה התעבות של החרוזים
  3. מדוד את אות של נעילה ב מגבר באמצעות אוסצילוסקופ.

נציג תוצאות:

בדיקה חזותית של חרוזים מצטברים הציג הבדל מובהק בין התגובה עם יעד והתגובה ללא המטרה. בכל התגובות עם יעד, חרוזים יצרו המצרפי אחת, צפופה נכנסו ויצאו קרן לייזר באופן להתאחד. עם זאת, התגובה ללא כל יעד, חרוזים היו מצטברים פחות תנועה שלהם היה פחות להתאחד (ראו תרשים 1).

איור 1
איור 1: בדיקה ויזואלית של immunoassay של כריך (א) ללא המטרה IL-8 (ב) עם יעד IL-8.

השעון אפנון מוט (צהוב) ואת אות פלט PMT (מג'נטה) תוך גילוי 0.48 פיקו גרם IL-8 יעד מוצגים באיור 1 (א). אפנון תדר עבור כל מוט נמצא הרץ 2. עם זאת, כפי שהיה צפוי תיאורטית, כאשר החרוזים להעביר את קרן הלייזר, PMT מזהה את אור ניאון ויש שיא מתח הפלט PMT. לכן, תדירות demodulation נמצא הרץ 4. כאשר האות PMT ואת השעון הוכפל אפנון (ב הרץ 4) ניזונים לנעול את המגבר ב, גלאי שלב רגיש מזהה את הסנכרון והתוצאות עם מתח גבוה (ראו תרשים 2).

איור 2
איור 2: (א) את השעון אפנון (צהוב) ואת האות PMT (מג'נטה), כאשר 0.48 זיהוי פיקו גרם IL-8 היעד. (ב) מנעול הביא מתח מגבר בשני סריקות שונות.

לנעול מגבר לא לזהות כל אות כאשר המדגם לשלוט נבדק. עובדה זו, יחד עם ההבדל החזותי צבירה עולה כי מערכת MMB ניתן לזהות בבירור את נוכחותם של יעד IL-8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסיכום, הראינו כי מערכת MMB יכול לשמש כדי לזהות נוכחות של היעד IL-8 בריכוזים נמוכים (0.5 גרם פיקו הוא גבול הגילוי של Bio-Plex מבחני ציטוקין Precision Pro [3,4]). היכולת של המערכת אינה מוגבלת IL-8 והוא יכול לשמש כדי לזהות חלבונים אחרים. היתרונות של מערכת MMB הן את היכולת לזהות את היעד במהירות ללא הפרדה או צעד כביסה. לכן, זה מקל על תהליך האיתור מאפשרת המערכת לשמש ביישומים בתחום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן הורוביץ Ishaya.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכה לזיהוי Cytokine IL-8 אנושי Bio-Plex ProBio-Rad171-B5008M
מטרה של IL-8 אנושי רקומביננטיThermo Fisher Scientific, Inc.R202625
נוגדן מונוקלונלי עכברי בביוטין נגד IL-8 אנושי G265-8BD Biosciences554718
חלבון פלואורסצנטי מצומד לסטרפטאווידיןBio-RadStreptavidin PE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
  2. Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
  3. Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
  4. Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IL 8Lock In Amplifier

מאמרים קשורים