מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin
במאמר זה
סיכום
תקציר
אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) הכוללים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם הנגרמת גזע pluripotent תאים (hiPSCs) הם מקורות תא מרגש עקב התחדשות עצמית שלהם יכולות בלתי מוגבלות הפוטנציאל שלהם להתמיין לסוגי תאים שונים. המדינה pluripotent של hPSCs נבחנת בדרך כלל על ידי טכניקות כגון qPCR, immunocytochemistry, ועל ידי אחרים
פרוטוקול
חלק 1: מכתים השעיה Immunocytochemical
- תאים נקצרים לתוך ההשעיה תא בודד.
- התאים מועברים לאחר מכן לתוך 1.5-2ml צינורות microcentrifuge ו centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות.
- תאים נשטפים החוצה על ידי aspirating supernatant, מחדש תלויה 1mL של PBS - (ללא Mg 2 + ו - Ca 2 +) ולאחר מכן centrifuged שוב למשך 4 דקות 200 גרם. זה צריך להיעשות פעמיים.
- לאחר כביסה, תאים מקובעים אז paraformaldehyde 1mL של 4% (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על ידי השעיית אותם מחדש.
- תאים נשטפים שוב פעמיים עם 1mL של PBS -.
- לאחר, על ידי שטיפת התאים לחסום מחדש השעיית אותם 1mL הפתרון בלוק (6% serum/94 PBS% -). דגירה אלה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
- לאחר, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות לשאוב את הפתרון חסום. Re-להשעות תאים 1mL הפתרון נוגדן ראשוני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ). תאים יכולים להיות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה לפני שתמשיך לשלב הבא.
- תאים נשטפים לאחר מכן פעמיים עם 1mL הפתרון חסום.
- לאחר, מחדש תאים להשעות 1mL של פתרון נוגדנים משני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
- אחרי שעה 1, תאים אמור להיות שטף שוב פעמיים עם 1mL הפתרון חסום.
- אחרי כביסה עם הפתרון בלוק, לכבס שוב עם תאים 1mL של PBS -.
- לאחר שוטף שונים, מחדש תאים להשעות 1mL של DAPI גרעיני כתם (1:10,000 דילול DAPI ב PBS -) ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- אחרי 5 דקות, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות. לשאוב את הפתרון גרעיני DAPI כתם מחדש להשעות תאים 1mL של PBS -.
חלק 2: התאגדות של hPSCs בשקופיות שנוצר באמצעות מנגנון cytospin
- מגלשות פלסטיק מוכנים ידי הפיכת הסכום הרצוי בהם חורים עם העיתונות תרגיל. הקוטר צריך להיות לכל היותר 1 מ"מ גדול יותר בקוטר הרחב ביותר של קצה micropipette (ים) לשמש.
- נייר מסנן לחתוך את הפרמטרים של השקופית פלסטיק עם מספריים.
- חורים נעשים אז בעיתון הסינון. גודלו של החור (ים) צריך להיות גדול מספיק, כי את קצה micropipette (ים) מתאים מלבב דרכו.
- אחרי אחד שקופיות פלסטיק מוכנים ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית ממוקם בחלק התחתון של הנייר לסנן בסלע (איור 1). השכבות מובטחות עם הקלטת.
- מקסימום של 100μL (תלוי בצפיפות monolayer הרצוי) של ההשעיה תא מוכתם חלק 1 ממוקם מכן לתוך החלק העליון של קצה micropipette (ים).
- במידת הצורך, המנגנון עם פתרון התא יכול להיות שקל ומאזן נגדית של משקל דומה נוצר.
- מנגנון cytospin ו לאזן יכול ממוקמות אז בצנטריפוגה שולחניים centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, המנגנון cytospin הוא מפורק בזהירות באופן doesn't לסלק את התאים מן שקופיות הזכוכית.
- אם יש צורך, PBS שמסביב עודף - בצד זכוכית aspirated החוצה.
- תאים לאחר מכן ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק אם monolayer תא הרצויה הושגה.
חלק 3: שקופיות הרכבה
- ירידה של התקשורת הרכבה הרצוי ממוקם ישירות במרכז של כל אזור המכיל תאים.
- לאחר, להחליק כיסוי הוא הוריד בעדינות על גבי שקופיות מנסה להימנע בועות אוויר אם זה אפשרי.
- התקשורת הרכבה עודף מוסר אז משקופיות.
- אחרי, צד של תלושי לכסות חתומות עם מסמר לכה.
- השקופיות יכולים להישמר בשטח אחסון כהה עד התוצאות הם נצפו ותועדו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לענין במעבדה שלנו, צלחת 35mm של תא גזע תרבויות גדל על fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הוא המוקצב ההליך מכתים immunocytochemical לשימוש עם מנגנון cytospin. התאים נאספים אז באמצעות האנזימטית passaging, הסרת כמה שכבת MEF ככל האפשר, תוך השעיית תא בודד. אם גזע יותר יעיל תא הבידוד מהשכבה MEF הוא הרצוי, מושבות יכול להיות מעוכל לאחר מכן באופן ידני הרים לתוך ההשעיה. אם התנאים מזין חינם משמשים גדל בתאי גזע תרבויות, המושבות יכול להיות פשוט לגרד ו מעוכל לתוך ההשעיה. למרות ההשעיה הראשונית תא ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
מימון חלקי עבור עבודה זו סופק על ידי קריירה NSF 0744556 (Rao) וכן מלגה דרך VCU-HHMI המדע החינוך תוכנית המחקר (פסקואל).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שקופית תא Lab Tek Permanox | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | חומר לשקופיות פלסטיק לשימוש חוזר |
| שקופיות מיקרוסקופ Superfrost/Plus מנוקות מראש | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| טיפים עם מסנן 0.1-10μL | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| זכוכית כיסוי למיקרוסקופ | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | תושור להרכבה |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| סרום עיזים נורמלי | Invitrogen | 10000C | |
| נוגדן מונוקלונלי Mouse Anti-SSEA-4 | EMD Millipore | MAB4304 | נוגדן ראשוני לצביעת SSEA-4 |
| נוגדן מונוקלונלי Rat Anti-SSEA-3 | EMD Millipore | MAB4303 | נוגדן ראשוני לצביעת SSEA-3 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11029 | נוגדן משני לצביעת SSEA-4 |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen | A11006 | נוגדן משני לצביעת SSEA-3 |
| DAPI, Dihydrochloride | Calbiochem | 268298 |
מקורות
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
