חילוץ ה-DNA של חיידקים במעיים של טרמיטים (Zootermopsis Angusticollis) באופן חזותי חיידקים גוט

סיכום

וידאו זה מדגים את הטכניקה להפקת DNA של זנים של חיידקים במעי האחורי תושב טרמיטים. ההכנה של שקופית הר רטוב, אשר הוא שימושי עבור לדמיין את הקהילה חיידקים במעיים מודגם גם, סיור דרך הסביבה, מינים עשיר הבטן הוא נתון.

תקציר

הטרמיטים הם בין החיות כמה שידוע יש את היכולת להתקיים אך ורק על ידי עץ רב. בדרכי המעיים טרמיטים מכיל אוכלוסייה צפופה של חיידקים מינים עשיר המסייע השפלה של lignocellulose בעיקר לתוך אצטט, מרכיב מפתח תדלוק מטבוליזם טרמיטים (Odelson & Breznak, 1983). בתוך אלה אוכלוסיות חיידקים הם חיידקים קדומים methanogenic, ובחלק ("נמוך") טרמיטים, אוקריוטים פרוטוזואה. לפיכך, טרמיטים הם נושאי מחקר מעולה לחקר יחסי הגומלין בין מינים של חיידקים ושל פונקציות ביוכימיים רבים שהם מבצעים לטובת המארחות. הרכב זנים של אוכלוסיות חיידקים במעיים טרמיטים וכן הגנים המרכזיים המעורבים בתהליכים ביוכימיים שונים נחקר תוך שימוש בטכניקות מולקולריות (Kudo et al, 1998;. Schmit-וגנר et al, 2003;. Salmassi & לידבטר, 2003). טכניקות אלו תלויים החילוץ וטיהור איכותיים חומצות גרעין מהסביבה בטן טרמיטים. טכניקת מיצוי המתואר וידאו זה הוא אוסף שונה של פרוטוקולים שפותחו להפקת וטיהור של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות (מור et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & לידבטר, 2003;. Ottesen et al 2006), הוא מייצר DNA מן החומר במעי האחורי טרמיטים מתאים לשימוש כתבנית לתגובת שרשרת פולימרז (PCR).

פרוטוקול

סיכום פרוצדורלי להפקת שלם במעי טרמיטים DNA:

1. טרמיטים צ'יל על הקרח, להסיר במעיים באמצעות פינצטה סטרילי ולייצב דגימות המעיים במאגר.
2. Homogenize דגימות PVPP / SDS / חיץ פנול.
3. תמצית ולטהר דנ"א lysate גולמי באמצעות Qiagen עמודות DNeasy.

פרוטוקול:

1. על קרח, להסיר את האומץ של כת טרמיטים עובד באמצעות מלקחיים סטרילית.
2. מיד להעביר את אומץ התכנים צינור סטרילי nuclease חינם, המכיל 50 μL קר כקרח 1x ביולוגיה מולקולרית כיתה TE חיץ (1 mM טריס-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). להקפיא דגימות -20 ° C, או להמשיך ישירות עם homogenization.
3. העברת דגימות המעי חיץ צינור סטרילי, nuclease ללא מ"ל 2 בורג כתרים טעון מראש עם 500 מ"ג של zirconia / סיליקה חרוזים סטרילית (0.1 מ"מ) ו - 700 μl של חיץ TE 1x המכיל 1% w / v polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
4. הוסף 50 μl של סולפט 20% נתרן dodecyl (SDS) ו - 500 μl של פנול על דגימות.
5. Homogenize (פעימה חרוז) על הגדרת הגבוהה ביותר באמצעות שלושה מחזורים של 30 שניות homogenization ו 30 שניות של מצמרר על הקרח.
6. משקעים חומר מסיס 1 דקות ב 8000 x גרם.
7. לטהר 300 μl aliquots של השכבה (העליון) מימית עם עמודות Qiagen DNeasy בשיטה המתוארת לטיהור lysate גולמי.
8. לכמת תוכן חומצות גרעין דגימות להקפיא ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.

דיון

מניסיוננו, DNA המופק הקהילות מיקרוביאלי של עץ האכלה מינים טרמיטים כמו nevadensis Zootermopis טהור מספיק עבור תבנית PCR לאחר סבב אחד של מיצוי וטיהור. עם זאת, כמה טרמיטים כגון האכלה, המלטה ואדמה האכלה המינים יכולה להיות ריכוז גבוה של חומצות humic של תוכן המעיים שלהם והן עשויות לחייב טיהור נוסף של ה-DNA של חיידקים במעיים. התשואה DNA הכולל את הקרביים של 5 עובדים צ'nevadensis הוא בטווח של 10-30 מיקרוגרם. עבור מינים טרמיטים משמעותית קטן או גדול יותר ממין זה, דגימות יותר או פחות עשוי להיות נחוץ כדי להשיג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PVPP/SDS/phenol	בופר			בופר הומוגניזציה
DNeasy Tissue Kit	ערכה	Qiagen	77607	בשימוש בהתאם לפרוטוקול לבידוד DNA גנומי מליזאטים גולמיים (נספח H, גרסת מדריך המוצר: יולי 2003)
TE	בופר	Sigma-Aldrich	T9285	בופר 1x (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) מריכוז של 100x
חרוזי זירקוניה/סיליקה	ציוד עזר	Biospec Products	11079101z	0.1 mm
PVPP	ריאגנט	Sigma-Aldrich	P6755	1% w/v polyvinylpolypyrrolidone שהוכן מריאגנט יבש כתליה של 1x בבופר TE
Zootermopsis nevadensis	בעל חיים			טרמיטים
SDS	ריאגנט	Sigma-Aldrich	L4390	תמיסת Sodium dodecyl sulfate 20% במים מריאגנט יבש
פנול	ריאגנט	Sigma-Aldrich	77607	רווי TE, ~73%
MiniBeadbeater-8	כלי	Biospec Products	963
BSS	תמיסת מלחים עם בופר, pH 7.2			הרכב לליטר: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, ו-10 mL של תמיסת 1 M של NaHCO3
AxioPlan-2	מיקרוסקופ	Carl Zeiss, Inc.		מאובזר בעדשה אובייקטיבית 40x, optivar 1.6x ועדשות אוקולריות 10x. הדגימות נבחנו באמצעות תאורה בניגודיות פאזה (phase contrast)