Method Article

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג'ין

DOI:

10.3791/1963

⸱

June 12th, 2010

 , 
1Dept. Of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג'ין להציג פלסמיד דנ"א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular (BiFC)

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת פונקציה הגן באורגניזמים שונים מסתמך על הידע של איך את המוצרים גן לתקשר אחד עם השני בסביבה הסלולר הרגיל שלהם. את הקרינה bimolecular השלמה (BiFC) Assay

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. הכנה פלסמיד

ה-DNA פלסמיד המשמש הפגזה חייב להיות של טוהר גבוהה בריכוז של 500ng/μl או יותר. עבור BiFC הכולל שתי בונה פלסמיד, 25 מיקרוגרם של כל פלסמיד הוא זקוק. במילים אחרות, 1:01 יחס טוחנת של שני פלסמידים צריך להיות מעורב כדי להצמיח DNA 50 מיקרוגרם סך פלסמיד להכנת מחסניות. שימו לב כי הוספת ה-DNA יותר מ 50 מיקרוגרם עלול לגרום הצטברות של חלקיקי זהב יש להימנע. זמין מסחרית פלסמיד דנ"א ערכות חילוץ מומלץ לבודד DNAs פלסמיד.

וקטורי פלסמיד צריך להיות קטן יחסית בגודל כגון pUC19. אנו משובטים שאו ו LUH cD....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. עבור משתמשים בפעם הראשונה, מומלץ לתרגל את ההליך כולו, מתוך הכנה מחסנית אל תצפית, עם כתבת אחת מכוננת פלסמיד כגון 35S:: GFP או 35S:: גאס. השתמשנו 35S:: GFP פלסמיד המתקבל בני הזוג. סטיב הר Xiaoning אנג 6 (איור 1 א, ד). ירו גן לשלוט מחסניות נמכר RioRad (חתול 165-2244) אינם מתאימים לצמחים.
  2. עבור BiFC, שליטה חיובית השני הוא הכרחי, שאמור לכלול שני השותפים באינטראקציה ידוע התמזגו השברים בטרמינל C-N-מסוף של.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בני הזוג. סטיב הר Xiaoning ז'אנג עבור 35S:: GFP pGlowbug לבנות את האחווה Hokensen דוקטורט כדי CH מחקר במעבדה צ's L'נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של ​​מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
בצל צהובכל ספק
Helios Gene GunBio-Rad
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים מתאימים עבור GFP או YFPZeiss, Nikon, Olympus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
  2. Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular Fluorescence ComplementationProtein Protein InteractionOnion Epidermal CellsHelios Gene GunFluorescence MicroscopyPlasmid BombardmentGold Particle CoatingSEU LUH InteractionYFP Fluorescence DetectionNegative Control Assay

Related Articles