הרכבת מוחות דרוזופילה בוגרים: שיטה להכנת שקופיות לדימות קונפוקלי

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. הרכבת מוח בוגר D. melanogaster על מיקרוסקופ שקופיות והדמיה

1. בנה שקופית "גשר". הניחו שני כיסויי "בסיס" במרחק של כ-1 ס"מ זה מזה על מגלשה טעונה חיובית. ודא שהצד הטעון חיובית של המגלשה פונה כלפי מעלה. הדביקו את הכיסויים לשקופית עם לק לציפורניים כפי שמוצג באיור 1A. בדרך כלל מועיל לאטום את שלושת הקצוות החיצוניים של כל החלקת כיסוי בסיס עם לק ציפורניים כדי להבטיח שאמצעי ההרכבה לא יתפתלו מתחת להחלקות כיסוי בסיס אלה. יש לתת ללק להתייבש לחלוטין (10 - 15 דקות) לפני שתמשיך.
2. הניחו את המגלשה מתחת לסטריאומיקרוסקופ ופיפטה את תמיסת המדיה המכילה את המוחות המנותחים לתוך החלל שבין שתי הכיסויים. כדי לספק ניגודיות רבה יותר, כדאי לתמרן את אורות צוואר האווז כך שיהיו מקבילים לראש הספסל.
3. הסר מדיה הרכבה נוספת מן השקופית באמצעות פיפטה, נזהר לא pipette את המוח מן השקופית.
4. פתל מדיית הרכבה נוספת. זה יאפשר למוח להיות ממוקם בצורה מדויקת יותר במהלך השלב הבא.
5. באמצעות זוג מלקחיים והסטריאומיקרוסקופ, מקמו את המוחות על המגלשה בתבנית רשת עם אונות אנטנה הפונות כלפי מעלה.
6. הניחו פתק כיסוי ("הגשר") מעל המוח (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1A). השתמשו בלק לציפורניים כדי לאטום את צידי החלקת כיסוי הגשר במקום שבו הם באים במגע עם החלקות כיסוי "הבסיס".
7. בעזרת פיפטה p200, מלאו באיטיות את החלל המרכזי מתחת לגשר באמצעי הרכבה טריים (איור 1B). הניחו טיפה אחת בכל פעם על הקצה הפתוח של המכסה המרכזי ואפשרו למדיית ההרכבה להתפתל מתחת למכסה הגשר המרכזי. המשיכו עד שכל החלל מתמלא באמצעי הרכבה, ואז אטמו את החלק העליון והתחתון בלק שקוף.
8. לאחר שהלק יבש, דמיינו את השקופיות מיד או אחסנו בקופסת שקופיות הדוקה חסינת אור בטמפרטורה של -20°C.
9. בתוך שבוע, המוח מצלם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם לייזר עירור וקוביות סינון המתאימות לנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים שנבחרו. תמונות Z-stack של נוירונים בגוף פטריות מתקבלות בדרך כלל באמצעות מטרות של 20X או 40X. הדמיה של נוירונים קולטי אור ברשתית עשויה לדרוש הגדלה גבוהה יותר.

איור 1: הרכבת מוחות כהכנה לדימות אימונופלואורסצנטי. (A) מוחות מורכבים על מגלשות SuperFrost Plus עם כיסוי גשר כדי למנוע שיטוח של המוחות. שני פתקי כיסוי "בסיס" מודבקים למגלשה טעונה חיובית של Superfrost Plus עם לק שקוף לציפורניים ומוחות מנותחים מונחים על המגלשה ביניהם. פתק כיסוי "גשר" שקוף מונח מעל המוח ומודבק לפתקי כיסוי הבסיס. (B) לאחר שהלק התייבש, Vectashield נמרח באיטיות מתחת לגשר כדי לשמר את הפלואורסצנטיות של הנוגדן המשני. לאחר מכן משתמשים בלק שקוף כדי לאטום את החלק העליון והתחתון של כיסוי "הגשר". לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.