דיסקציה של המעי התיכון מזבוב בוגר: שיטה לבידוד מערכת העיכול

תקציר

מקור: Tauc, H. M., et al. בידוד תאי גזע במעי ממעי דרוזופילה בוגר על ידי FACS לחקר התנהגות תאי גזע במהלך ההזדקנות. J. Vis. Exp. (2014).

בסרטון זה אנו מדגישים דיסקציה של מעי דרוזופילה בוגר ואוסף של מעי אמצע המתאים לדיסוציאציה של תא בודד ו- FACS על מנת לבודד תאי גזע במעי.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Tauc et al., בידוד תאי גזע מעיים ממבוגרים Drosophila Midguts על ידי FACS לחקר התנהגות תאי גזע במהלך ההזדקנות, J. Vis. Exp. (2014).

הערה: אם פרוטוקול זה משמש בפעם הראשונה לבידוד ISCs על-ידי מיון FAC, הפקדים הבאים הם הכרחיים כדי להגדיר תחילה את פרמטרי FACS כראוי: תאים מנותקים מסוג פראי (למשל w¹¹¹⁸) דרוזופילה midguts ללא Sytox. תאים מנותקים מסוג פראי (למשל w¹¹¹⁸) Drosophila midguts עם Sytox (ראה שלב 3.6). תאים מנותקים מאמצע המעי של קו הזבובים ESG-Gal4, UAS-GFP ללא Sytox.

1. הכנת תמיסות וכלים לדיסקציה של המעי

1. הכינו 4-6 בקבוקונים שכל אחד מהם מכיל 40 נקבות זבובים מקו הזבובים ESG-Gal4, UAS-GFP.
2. מתוך 10x PBS מלאי פתרון להכין 500 ml 1x PBS (1.8 mM NaH₂PO₄·H₂O, 8.4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, להתאים pH ל 7.4).
3. הכינו תמיסת אגרוז 3.5% ב-1x PBS (3.5 גרם אגרוז בדרגת אלקטרופורזה ב-100 מ"ל 1x PBS). מכינים צלחות דיסקציה על ידי יציקת תמיסה זו לתוך כלי פטרי (קוטר 8.5 ס"מ) כדי לכסות את התחתית. שכבת האגרוז מונעת פגיעה בקצות המלקחיים במהלך הליך הנתיחה. לאחר שהג'ל התמצק, יש לאחסן את צלחות הדיסקציה בטמפרטורה של 4°C.
4. הכינו 300 מ"ל של 1x PBS + 1% BSA טרי לפני הניתוח והניחו את הבקבוק על קרח או בטמפרטורה של 4°C.
5. הפעל את הצנטריפוגה ותן לה להתקרר ל 4 °C (75 °F).
6. להבעיר את הקצוות של 2 פיפטות פסטר זכוכית כדי להחליק את הקצוות.
7. נקו שני זוגות מלקחיים וסכין גילוח אחד עם 70% אתנול.
8. מניחים ארבע עד שש שפופרות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל לאיסוף מעיים מנותחים על קרח.

2. הכנת מערכת העיכול ודיסקציה של המעי התיכון

1. הרדימו זבובים מבקבוקון אחד (40 זבובים) עם_CO2 על מצע זבוב סטנדרטי, ערפו את ראשיהם של כל הזבובים באמצעות סכין גילוח והעבירו אותם לצלחת הדיסקציה. יוצקים תמיסת 1x PBS / 1% BSA קרה לתוך צלחת הדיסקציה כדי לכסות את ג'ל האגרוז. הזבובים יצופו.
2. תפוס את בטן הזבוב עם זוג מלקחיים אחד, תוך אחיזת בית החזה עם זוג המלקחיים השני. להפריד את בית החזה מן הבטן. המעיים יהיו גלויים לעין וסביר להניח שהמעי/היבול הקדמי עדיין יהיה מחובר לבית החזה.
3. תפוס את המעיים ומשוך אותו מבית החזה. כדי לפתוח את המעיים, לתפוס את היבול ולמשוך את המעיים מעט קדימה מן הבטן.
4. תפוס את הקצה האחורי של הבטן עם זוג מלקחיים אחד ואת קצה הקוטיקולה הפתוחה הקדמית עם זוג המלקחיים השני. היזהרו לא להרוס את רקמת המעי הבולטת. משכו את הקצה האחורי הצידה כדי לשבור את הקוטיקולה והמשיכו למשוך אחורית בעדינות רבה עד שכל המעי נשלף מחלל הבטן. ייתכן שיהיה צורך להסיר את היבול מראש אם הוא גדול מכדי להיכנס דרך חלל הגוף.
5. הסר את המעי הקדמי, צינוריות מלפיגיות, מעי אחורי ושחלות עוזב את המעי האמצעי החשוף.
6. בעזרת פיפטה פסטר מזכוכית, מעבירים את אצווה של מידגוטים מנותחים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל תמיסת PBS / 1% BSA קרה ושומרים את הצינור על קרח. יש לעבד את הדגימות תוך שעתיים.
7. לאחר השלמת הנתיחה של אצווה שלמה, שטפו את כלי הדיסקציה במים מזוקקים פעמיים כדי לשטוף את שאריות הפסולת. התחילו לנתח את האצווה הבאה של המעיים (חזרו על שלבים 2.1–2.7). נתח כמה שיותר אצוות תוך שעתיים, ולאחר מכן המשך לשלב 3.1.

3. עיכול רקמת המעי לקצירת תאים למיון FAC

1. הסר את תמיסת 1x PBS/1% BSA מהמעיים האמצעיים והוסף 500 μl של תמיסת טריפסין-EDTA 0.5% לכל דגימה.
2. מערבלים היטב במשך 20 שניות ודגרים על הדגימות על ידי נדנוד/סיבוב עדין ב-20 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 25-30 דקות.
3. מערבלים שוב לאחר כ-30 דקות ומניחים לרקמת המעי האמצעית השלמה לשקוע לתחתית הצינור. הסר בזהירות את התאים הנמצאים בתרחיף עם פיפטה פסטר זכוכית בוערת וסנן אותם דרך רשת ניילון 35 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי 1.5 מ"ל.
4. סובב את התאים כלפי מטה ב 100 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שימו לב, כאשר מתחילים את העיכול, כדור תא עשוי שלא להיראות בהתחלה, אך יהפוך לגלוי ככל שעיכול הרקמה מתקדם.
   1. העבירו בזהירות את תמיסת הטריפסין חזרה לצינורית הדגימה המקורית המכילה את רקמת המעי האמצעית השלמה שנותרה. הימנעו מהעברת תאים רבים מדי מהכדור.
   2. השהה מחדש בעדינות את גלולת התא ב-400 מיקרוליטר קר 1x PBS / 1% BSA. שמור את צינורות microcentrifuge המכילים את התאים מנותקים על קרח לכסות את הצינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על התאים מפני אור.
   3. מערבבים שוב את תמיסת הטריפסין המכילה את רקמת המעי האמצעית השלמה שנותרה ומניחים את הדגימות על הנדנדה למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
5. חזור על שלבים 3.3 עד 3.4.3 עד שכל רקמת המעי האמצעית מתעכלת. שלב את התאים המנותקים מכל צינורות המיקרוצנטריפוגות לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. זה עשוי לדרוש שלב צנטריפוגה כמו ב 3.4, שכן נפח כל מתלי התא יחד עשוי לעלות על 1.5 מ"ל. שמור את תרחיף התא על קרח והגן על התאים מפני אור.
6. סובב את התאים המנותקים כלפי מטה ב 100 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר כמה שיותר supernatant משאיר כ 50-100 μl של 1x PBS / 1% BSA תמיסת בצינור microcentrifuge. השהה מחדש בעדינות את התאים המנותקים ב- 800 μl 1x PBS / 1% BSA המכיל Sytox (1:20,000).
7. מעבירים את מתלה התא לצינור פלקון תחתון עגול בנפח 5 מ"ל על ידי סינון התאים דרך מכסה הצמדה של מסננת התא (רשת ניילון 35 מיקרומטר). שמרו תמיד דגימות תאים על קרח ומוגנות מפני אור. התאים מוכנים כעת למיון.
8. פיפטה 600 μl של תמיסת RNAlater לכל צינור מיקרוצנטריפוגה שאליו ימוינו התאים לבידוד RNA עוקב. עבור יישומים אחרים במורד הזרם, התאים יכולים להיאסף בתמיסה אחרת, למשל PBS סטרילי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים: Dumont, Inox Biologie #5	כלים מדעיים משובחים	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (רשת ניילון 35 מיקרומטר)	ספר	3A03-0150-102-00
פלקון 5 מ"ל מבחנה עגולה תחתונה לבדיקת פוליסטירן עם מכסה הצמדה למסננת תאים	קורנינג	352235
פולימקס 1040	היידולף	543-42210-00
אלבומין מסרום בקר (BSA)	סיגמא	A4503-50G
0.5% טריפסין-EDTA	Invitrogen	15400-054	טריפסין המתקבל מחברה אחרת ככל הנראה יש פעילות שונה ואת משך העיכול טריפסין צריך להיות מותאם בהתאם.
SYTOX Blue Dead Cell Stain עבור ציטומטריית זרימה	לייף טכנולוגיות	S34857
פתרון ייצוב RNAlater	לייף טכנולוגיות	AM7023	פתרונות אחרים, למשל, Trizol יכול לשמש לבידוד RNA לאחר מכן
סדרן תאים FACSAria II	בקטון דיקינסון		הפעל שעה אחת לפני המיון