הכנת דגימות למטבולומיקה: שיטה להכנת דגימות תאים לפרופיל מטבוליטים

תקציר

מקור: Zhao, Y. C. et. al., ביולוגיה מערכתית של ויסות מטבולי על ידי איתות קולטן אסטרוגן בסרטן השד. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר טכניקה להכנת דגימות תאי סרטן השד לפרופיל מטבוליטים. תאי סרטן השד מטופלים באסטרדיול, הנקשר לקולטן האסטרוגן אלפא וגורם לשינוי בהרכב המטבוליטים.

פרוטוקול

1. הכנת מדגם Metabolomics Assay

1. תרבית תאים וטיפול בהם
   1. זרעו 400,000 תאי MCF7 לצלחת של 10 ס"מ במדיום גידול. עבור כל טיפול להכין שלוש דגימות. השתמש בשני לוחות בכל דגימה כדי לקבל מספיק תאים לזיהוי. ביום השלישי, להסיר את המדיום ולהוסיף 5 מ"ל מדיום טרי עם או בלי ^10-8 M אסטרדיול או E2 לתאים. טפל בתאים במשך 24 שעות (37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂).
2. אוסף דוגמאות
   1. מוסיפים 5 מ"ל קר כקרח 1x PBS לצלחת, שואפים את PBS לאחר הטיה קצרה של הצלחת מספר פעמים. חזרו על הפעולה פעמיים, והסירו כמה שיותר PBS לאחר השטיפה האחרונה.
   2. מוסיפים 750 μl של אצטון טרום קר לכל צלחת ומגרדים את התאים. ערבבו את התאים באצטון משתי צלחות לצינור של 2 מ"ל על קרח.
   3. ספירת תאים לנורמליזציה
      1. עבור כל טיפול, השתמש בשתי פלטות נוספות לכימות תאים. כדי לנתק את התאים מהצלחת, הוסיפו 2 מ"ל של חיץ HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0.075% NaHCO₃ ו-1 mM EDTA) לכל צלחת ודגרו במשך 5 דקות.
      2. לאסוף ולערבב היטב את התאים על ידי pipetting תאים במאגר HE. השתמש בסך הכל בתמיסת תא של 20 μl כדי לספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר.
3. אחסן את הדגימות ב -80 ° C לפני שליחה למרכז Metabolomics כדי לזהות ולכמת את המטבוליטים באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה גז (GC-MS).