יחסי In vivo לימוד Adjuvanticity gp96 ב הצפרדע Xenopus laevis</em

סיכום

הצפרדע Xenopus laevis מספק מודל אטרקטיבי חלופי שאינו לחקר יונקים את היכולת של חלבון הלם חום כגון gp96 לקדם אנטיגן ספציפי CD8 T התגובות התא. אנו מציגים שיטות מחקר In vivo סיוע של המצגת הנגדית של אנטיגנים סרטניים בעור על ידי gp96.

תקציר

פיתחנו את Xenopus דוחי laevis מודל ייחודי שאינם יונקים ללמוד את היכולת של חלבונים מסוימים הלם חום (hsps) כגון gp96 כדי להקל צולבות הצגת אנטיגנים מלווה ומעוררים מולד אדפטיבית התגובות תא T. Xenopus דחיית שתל עור מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד את היכולת של gp96 לעורר קלאסית MHC בכיתה Ia (Ia בכיתה) מוגבלת התגובות תא T. בנוסף, מערכת מודל Xenopus גם מספק חלופה אטרקטיבית כדי עכברים לחקור את היכולת של gp96 ליצור תגובות נגד גידולים יש למטה מוסדר בכיתה Ia שלהם מולקולות ובכך להימלט מעקב החיסונית. לאחרונה, פיתחנו תא המאמצת להעביר assay ב Xenopus באמצעות שיבוטים leukocytes הצפק כמו תאים הצגת אנטיגן (נגמ"שים), וכן הראו כי gp96 יכולה הממשלה CD8 T התגובות תא in vivo נגד אנטיגנים עור קלים histocompatibility כמו גם נגד הגידול Xenopus הרתי 15 / 0 זה לא להביע Ia מולקולות בכיתה. אנו מתארים כאן את המתודולוגיה המעורבים לבצע את מבחני לרבות העברה, התמחרות פועם המאמצת של לויקוציטים הצפק, וכן השתלת עור מבחני השתלת הגידול. בנוסף אנחנו גם המתאר את קצירת והפרדה של לויקוציטים דם היקפיים המשמשים cytometry זרימה מבחני התפשטות המאפשרים אפיון נוסף של אוכלוסיות מעורבות מפעיל דחייה העור אנטי הגידול התגובות.

פרוטוקול

1. בעלי חיים

X. laevis x X. גילי כלאיים LG-6 ו-LG-15 isogenetic שיבוטים ¹ הם מהמושבה הרבייה שלנו באוניברסיטת רוצ'סטר (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 ו-LG-15 חולקים את אותו haplotype MHC הטרוזיגוטיים (א / ג) אך נבדלים ב histocompatibility (H) לוקוסים קטנים. הצאצאים של שיבוטים אלה מיוצרים על ידי gynogenesis, שבו ביצים דיפלואידי המיוצר על ידי הנקבה מופעלים על ידי הזרע-UV מוקרן (אין תרומה דנ"א הצאצאים).

השימוש בכפפות היא שברשות. יש אנשים שמעדיפים לא ללבוש אותם כי זה קשה יותר להתמודד עם צפרדעים (חלקלק), ולמעשה נראה להפוך את הצפרדעים לא נוח.

2. טיהור gp96 מגידול 15 / 0 (מבטא גידול מינור H-AGS)

Gp96 טיהור תוארה בעבר ^{2, 3.} בקצרה, gp96 מטוהרים על ידי חלוקה 50-70% אמוניום סולפט, ואחריו conA-sepharose ו DEAE כרומטוגרפיה. כ 20-50 מיקרוגרם של החלבון ניתן להשיג לכל 1 מ"ל של רקמת הגידול. טוהר הכנה נקבעת על ידי SDS-PAGE ו מכתים רסיס.

3. ההתמחרות ואת הקציר של Leukocytes הצפק (הפרספקטיבה) של מינור H-Ag-LG-6 שונות צפרדעים

1. לגדול בין לילה 25 מ"ל E. קולי תרבות צינור חרוטי 50 מ"ל ב 37 ° C עם רעד.
2. החום למחרת להרוג את החיידקים על ידי זה רותחים במשך שעה 1.
3. צנטריפוגה החום הרג E. קולי במשך 15 דקות ב 2000 סל"ד (1,500 גרם) בשעה 4 ° C.
4. הסר את supernatant ו resuspend גלולה חיידקי ^ה 1 / 10 נפח תרבות המקורי (2.5 מ"ל) ב APBS. בנקודה זו את התרבות חיידקי מוכן לשימוש וצריך להשתמש בו בתוך 24 שעות.
5. הזרק intraperitoneally (IP) 200 (עבור צפרדע 2 אינץ') או 300 μL (עבור צפרדע 3 אינץ') של הכנת חום הרג חיידקים לכל צפרדע באמצעות מד 25 08/05 מחט.
6. שלושה ימים לאחר הזרקת הפרספקטיבה נקצרים על ידי שטיפה intraperitoneal.
7. לפני קציר PL, צפרדעים מבוגר מורדמים על ידי טבילה בתמיסה מימית 0.1% sulfonate מתאן tricaine (TMS, MS-222) שנאגרו עם סודיום ביקרבונט עד 5 דקות עד כל תנועה מפסיק (משך תלוי בגודל וגיל). בעקבות בעלי חיים בתוך 10-20 דקות לאחר הטיפול.
8. לחטא את הבטן של הצפרדע עם כמות קטנה של אתנול 70%.
9. הזרק 5 מ"ל (עבור צפרדע 2 אינץ') או 10 מ"ל (עבור צפרדע 3 אינץ') של APBS סטרילי מחומם מראש בטמפרטורת החדר לתוך חלל הצפק באמצעות מד 18 ½ 1 מחט. הסר את המחט בעדינות לעסות את הצפרדע לרגע כדי להבטיח את מאגר מוזרק equilibrates עם נוזל בחלל הגוף.
10. השתמש מד חדש 18 ½ 1 ללא מחט מזרק כדי לאסוף את הנוזלים הצפק כי יהיה טפטוף מהחלק האחורי של המחט לתוך צינור נקי מ"ל 50 חרוטי. הקפד להחזיר כמה שיותר נפח מוזרק הראשונית האפשרית. להיזהר כלי הדם באזור המרכזי של אזור הבטן.
11. לאחר הפרספקטיבה נקצרים לשים את הצפרדע בכלי עם מים רדודים עד שהוא ער ובשלב זה ניתן להציב לתוך הכלוב.

4. העברת פועם המאמצת של LG-6 Pls Into תמים Lg-6 נמענים

1. שטפו את הפרספקטיבה פעם עם APBS קר צנטריפוגות אותם 1,000 סל"ד (750 גרם) במשך 10 דקות ב 4 ° C.
2. הסר את supernatant ו resuspend קווי הפרספקטיבה APBS.
3. דופק הפרספקטיבה עם gp96 בריכוז של 1 מיקרוגרם gp96 לכל 5 x 10 ⁵ הפרספקטיבה.
4. פעם את הכמות המתאימה של gp96 מתווספת הפרספקטיבה, לערבב אותם על ידי pipeting ו לדגור על הקרח במשך שעה 1.
5. צנטריפוגה התאים גם בסל"ד 1000 עבור 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס או 14,000 סל"ד דקות 1 להסיר כל מאוגד gp96.
6. שטפו את הפרספקטיבה 3X עם APBS קר כדי להבטיח שאין שמאל שיורית gp96.
7. Resuspend הפרספקטיבה פעמו בריכוז של 5 x 10 ⁵ הפרספקטיבה לכל μL 300.
8. Adoptively להעביר הפרספקטיבה בזריקה IP באמצעות 25 מד 08/05 מחט. להזריק 300 μL של קווי הפרספקטיבה פעמו (5 x 10 ⁵ תאים) לכל בעל חיים.
9. צפרדעים צריך להיות דרוך לפחות 3 ימים לפני שתמשיך עם שתל עור או ניסויים אתגר הגידול.

5. שתל עור Assay

דחיית שתל עור הוא assay ומבוססת Xenopus ^{4, 5, 6.} ב Xenopus, לנמען דוחה העור תורם מציג 1 או 2 אי התאמות haplotype MHC בתוך 18-22 ימים 21-22 ° C. לעומת זאת, שתלי עור בין LG-6 ו-LG-15 שיבוטים שונים רק על ידי קטין H-AGS נדחות לאט יותר (יותר 30 ימים). אולם, שלילה זו הואצה מקבלי thaלא היה דרוך נגד התורם קטין H-AGS או על ידי שתל עור הקודמת או על ידי חיסון עם gp96 מטוהרים מן התורם. אין דחייה כלל מתרחשת כאשר התורם למקבל זהים גנטית (למשל, בעלי חיים משובטים או טהורים לחלוטין). לכן, טכניקה פשוטה זו היא חזקה מאוד לאפיון של המערכת החיסונית vivo שהושרו על ידי gp96.

1. הרדימי צפרדע התורם כפי שמתואר 3.7.
   הערה: רק אמצעי זהירות מינימליים צריכים להילקח מאז Xenopus לייצר עוצמה אנטי מיקרוביאליים פפטידים (למשל, magainin) בעור כי obviates את הצורך נהלים aseptic מוחלט. למעשה, הטיפול של צפרדע עם חומר חיטוי כלשהו עלולה להזיק לעור. בנוסף, Xenopus אין שום פתוגנים כי ניתן להעביר לבני אדם. לכן, השימוש בכפפות הוא אופציונלי. עם זאת, כל המכשירים המשמשים לנתיחה צריך להיות autoclaved פתרונות כל צריך להיות סטרילי.
2. גזור להסיר קטן (20 מ"מ X 5 מ"מ) פיסת עור הגחון (עור הבטן המופיע כסוף בשל נוכחותם של תאים פיגמנט irridophore) מן צפרדע LG-15 תורם באמצעות מספריים.
3. מניחים את העור APBS המכיל Petridish ולשמור על הקרח. לתפעל את רקמת העור בעדינות רבה, להימנע מחזיק אותו בין מלקחיים.
4. באמצעות תער או מספריים לחתוך שתלי הפרט לתוך 5 מ"מ X 5 מ"מ חתיכות. שמור את שברי APBS על הקרח.
5. בשלב זה הצפרדע התורם ממוקם במיכל עם מים רדודים עד שהוא ער ואז זה ממוקם מים המכילים אנטיביוטיקה (Penstrep בריכוז של 5 מ"ג / ליטר). צפרדע היא כל הזמן במים עם אנטיביוטיקה במשך יומיים ובשלב זה חזר במים רגילים. פצע קטן במקום שבו העור הוסר אינו צריך להיות תפרה ומרפא בתוך שבוע.
6. להרדים את הצפרדע LG-6 הנמען.
7. לעשות חתך קטן בעור (חזור) הגבי של הנמען והכנס את 5 מ"מ X 5 מ"מ השתל מתחת לעור עם הצד הכסוף למעלה. היזהר לא להכניס בועות אוויר גדולות מתחת לעור כי זה עלול להוביל עקירה או אפילו אובדן של השתל.
8. הקפד לציין את הסימנים מספריים ומלקחיים על שתלי כי אלה לא נחשבים דחיית שתל פעם הניקוד מתחיל.
9. 24 שעות מאוחר יותר חלק של העור מארח שכיסה צריך להסיר את השתל.
10. להרדים את הצפרדע LG-6 הנמען. ידית החיה כמתואר 5.1.
11. בעזרת מספריים autoclaved לגזור חלון סביב השתל, כך השתל ניתן דמיינו בחופשיות. היזהר שלא לגעת בעור התורם או כדי לגרום לדימום. בואו הצפרדע להתאושש כמתואר 5.5.
12. התחל הבקיע את השתל מיד על ידי לקיחת סקיצה. דחיית שתל העור נקבעת על ידי אחוז של הרס irridophores על העור מורכבים.
13. שתלי צריך להיבדק כל 2-3 ימים, אך בעלי החיים לא צריכים להיות מורדמים לכך. כדי להמחיש את שתלי, צפרדעים את הצורך להציב petridish תחת מיקרוסקופ לנתח.

6. Whole-Mount Immunohistology של העור המושתל

צפרדע כל הר immunohistology תוארה בעבר ^6. בקצרה, צפרדע הוא הרדים והניח מתחת למיקרוסקופ על מגבת נייר סטרילי מראש רטוב במים צפרדע (האזור הוא גם מוכן לעבוד בסביבה נקייה מחיידקים). העור המושתל הוא שנקטפו אז יחד עם כמות קטנה של העור המקיף המארח הוא מוכתם נוגדנים בדומה מכתים התא לצורך ניתוח תזרים cytometry ^6. מכשירים Autoclaved ו buffers סטרילי צריכים להיות בשימוש. לאחר מכתים את העור מושם על המיקרוסקופ שקופית ולחץ בעדינות להחליק עם כיסוי. בנקודה זו העור ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור אוכלוסיות תאים שונות הסתננו השתל. לאחר ההליך הצפרדע נשמר במים עם אנטיביוטיקה, כמתואר בסעיף 5.5. וחזר במים רגילים. הפצע קטן שמאל שבו העור הוסר מרפא בתוך שבוע.

7. אפיון Leukocytes דם

1. לפני הסרת דם הצפרדע, צריך להכין "מחטים זכוכית" על ידי משיכת סטרילי pipettes פסטר מעל להבה. הגפיים קנס של פיפטה מתחדדת תחת stereomicroscope. פיפטה מחוברת אז צינור פלסטיק השאיפה.
   כל המכשירים כגון מלקחיים ומספריים צריך להיות autoclaved לפני השימוש.
2. כמו כן להכין קר קרח 10 מ"ל של APBS פתרון הפרין ידי הוספת 50 יחידות הפרין לכל 1 מ"ל של APBS. שמור את הפתרון על הקרח. כל הפתרונות המשמשים צריך להיות סטרילי.
3. הרדימי צפרדע כמתואר 3.7, ופעל טיפול זהה חיה ההליכים כמתואר 5.1. .
4. חותכים את העור מעל כף הרגל האחורי לחשוףאת הווריד שורש הרגל הגבי.
5. מלאו את פיפטה פסטר עם 1-2 מ"ל של תמיסת + APBS הפרין.
6. הכנס את "מחט זכוכית" לווריד ולהתחיל לאסוף את הדם על ידי לאט aspirating עם הפה. חשוב לנו פתרון APBS + הפרין ב "מחט זכוכית" מאז זה ימנע את הדם קרישת וסותם את קצה המחט.
7. 1-2 מ"ל של דם ניתן לקבל צפרדע one בגודל ממוצע.
8. חתך קטן על רגל של צפרדע לא צריך להיות תפרה ואת הפצע מחלים תוך שבוע.
9. צנטריפוגה הדם בסל"ד 1000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
10. הסר את supernatant לשטוף את התאים 1X עם 10 מ"ל של APBS קר.
11. כיסוי 2 מ"ל של דם (1-5 x 10 ⁶ תאים) על מ"ל 1 של ficoll Histopaque 1.077 (Sigma) מראש חימם בטמפרטורת החדר על מנת להפריד את לויקוציטים מהדם את כדוריות הדם האדומות.
12. צנטריפוגה 20 דקות ב 1000 סל"ד בטמפרטורת החדר עם הבלם לא, ולאחר מכן לאסוף את הלהקה ליקוציט.
13. לשטוף את התאים 2X עם APBS ידי צנטריפוגה בסל"ד 1400 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את ficoll שיורית.
14. בשלב זה התאים מוכנים להיות מוכתם נוגדנים לניתוח cytometry זרימה, או להיות לשימוש ב מבחני חוץ גופית תרבות.

8. Assay גידול להשתלות

1. כשבוע לפני להפשיר את הניסוי מתוך משלוח חדש של תאים 15 / 0 הגידול לוודא כי התאים מתחילים לגדול היטב. בינוני תרבות מתואר בתמציתיות בסעיף הבא ביתר פירוט ^3.
2. הרחב את 15 / 0 תאים סרטניים.
3. ביום הניסוי, לספור את התאים לקבוע מוות של תאים על ידי הרחקה כחול Trypan. מוות של תאים צריך להיות פחות מ 5%. שטפו תאים 1X ב APBS קר, צנטריפוגה בסל"ד 1000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. Resuspend התאים בינוני תרבות הגידול בצפיפות של 5 x 10 ⁵ 15 / 0 תאים לכל μL 300.
5. 5 להשתלות x 10 ⁵ תאים בנפח 300 μL לכל צפרדע בזריקה תת עורית באמצעות מד 25 08/05 מחט בצד אחד של הצד (חזור) הגבי של החיה.
6. הגידול תתחיל תוך 2-3 שבועות לאחר אתגר הגידול. המראה הגידול הראשוני יש לציין את נפח הגידול צריך להיות מוקלט כל 2-3 ימים. גידול נפח (אורך X גובה X רוחב) נמדד באמצעות מחוגה.
7. לאחר הגידול גדל ל 3,500 מ"מ ³ או צפרדע מתחיל לחפש רדום, זה צריך להיות מורדמים על מנת למנוע אי נוחות.

9. ריאגנטים דרושה:

• דוחי בופר פוספט (APBS): 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L Na ₂ HPO _4, 0.2 ג'/ L KH ₂ PO. עד 7.5 pH באמצעות 10N NaOH ולסנן דרך עיקור 0.2 מיקרומטר הסינון.
• Tricaine Sulfonate מתאן (TMS, MS-222) (הסהר מחקר כימיקלים CAS # 886-86-2).
• סודיום ביקרבונט (פישר סיינטיפיק-S 233-500).
• Histopaque-1077 (סיגמא אולדריץ 10771-100 מ"ל)
• הפרין מלח נתרן (סיגמא אולדריץ H3149-50KU)
• תרבות בינונית Xenopus 15 / 0 גידולים [ראו 3 לפרטים נוספים]: 1 ליטר של המדיום DMEM Iscove הבזליים (Gibco-Invitrogen 11,965) עם אינסולין 10 מ"ל, 10 מ"ל שאינם חיוניים חומצות אמינו, 10 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם / mL של Kanamycin; 3 מ"ל של primatone (חטיבת מוצרי שפילד), 1 מ"ל של mercaptoethanol-β2, ו 3.02 גרם NaHCO ₃ במים (pH 7.0). בינוני זה מדולל כדי osmolarity דוחי ידי הוספת 30% מים מזוקקים כפול, בתוספת 5% נסיוב שור עוברית, superantant 20% לעומת A6 תא כליה Xenopus קו, 0.25% נורמלי Xenopus בסרום.

10. נציג תוצאות

באיור 1. ניתוח Stereomicroscopic של דחייה שתל עור 12 ימים לאחר ההשתלה. LG-6 צפרדע משובטים קיבלו שתל עור משני (א) זהה MHC-LG-6 (לא מראה שום דחייה) או (ב) תורם MHC-outbred שונים (80% דחייה). חצים מראה תאים iridophore כסוף פיגמנט סימון בריא (לא דחה) מורכבים רקמות. (*) סמן של מלקחיים לא בשל הדחייה.

איור 2. Gp96 מקלה צולבות מצגת של אנטיגנים סרטניים Xenopus. LG-15 הפרספקטיבה (5 x 10 ⁵⁾ היו פעמו עבור שעה 1 או על קרח עם APBS (שליטה שלילי), 1 מיקרוגרם של רקומביננטי gp96 מטוהרים מן E. תרבות קולי, או 1 או 0.5 מיקרוגרם של gp96 מטוהרים מ 15 / 0 רקמת הגידול. לאחר 3 שוטף, התאים הועברו adoptively לתוך LG-15 מקבלי מבוגר (1 x 10 ⁶ / בודדים). כעבור שלושה ימים לחיות 15 / 0 תאים סרטניים (5 x 10 ⁵⁾ היוהמושתלים בזריקה SC. העקומה מייצגת את הקינטיקה של הגידול ב צפרדע אחת. יום אתגר הודעה כאשר גידולים הופיע לראשונה נוטרו, וגודל הגידול נקבע מעת לעת (אורך x רוחב x עובי) קליפר.

דיון

Xenopus דוחי הוא מודל ייחודי צדדי שאינם יונקים ללמוד חסינות. השימוש הנרחב שלה מחקר ביו החיסונית הניב רבות כלי מחקר חשוב כמו שיבוטים MHC מוגדר LG-6 ו-LG-15 וכן שורות תאים שונות נוגדנים חד שבטיים. השימוש בכלים אלו הקמנו שונים במבחנה מבחני vivo ללמוד את היכולת של הלם החום חלבונים כגון gp96 לתווך חזק Ag ספציפי נגד קטין H-Ag ואנטי הגידול T התגובות תא ^7. זו מערכת מודל מאפשרת לנו להמשיך לחקור את המאפיינים החיסונית gp96 תחול במהלך שלבי תא מפעיל.

<...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים דרושים:
תמיסת סליין בופר פוספט למדומיים (APBS):
NaCl, 1.15 g/L
Na2אופטימיזציה של היפר-פרמטרים (HPO)4, 0.2 גרם/ליטר
KH2PO
NaOH בריכוז 10N
טריקאין מתאן סולפונט (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
נתרן ביקרבונט	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100ml
הפרין מלח נתרן	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
מצע גידול עבור גידולי Xenopus 15/0 [ראו 3 לפרטים נוספים]:
מדיום בסיסי Iscove DMEM	GIBCO, מבית Life Technologies	11965
אינסולין
חומצות אמינו שאינן חיוניות
פניצילין-סטRepartitionימיצין
קנמיצין
Primatone	חטיבת המוצרים של Sheffield
β2-מרקפטו–אתנול
NaHCO3
30% מים מזוקקים פעמיים
5% סרום עגל עוברי
20% שמישרי (supernatant) מקו תאי כליה של Xenopus מדגם A6
0.25% סרום Xenopus רגיל
<חזק>חומרים וציוד:
מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 50 ו-15 מ"ל (סטריליות)
מחטים סטריליות Precision Glide, מדד 25, אורך 5/8 אינץ'	BD Biosciences
מH 18 (Gauge 18)½ מחטי Precision Glide סטריליות	BD Biosciences
מזרק טוברקולין סטרילי עם קצה חלק, 1 מ"ל	BD Biosciences
מזרק סטרילי עם קצה חלק (Slip Tip), 10 מ"ל	BD Biosciences
מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (סטריליות)
צלחית פטרי מ-Polystyrene סטרילית, 60 X 15 מ"מ	Falcon BD
להבי תער
זכוכית למקרוסקופ מסוג Premium, 25 X 75 מ"מ X 1 מ"מ	Fisher Scientific
צלח Petri מזכוכית בקוטר 10 ס"מ
9" פיפטות פסטור Durex מזכוכית בורוסיליקט, חד-פעמיות, עם פקק כותנה	VWR international
צינורות Tygon
שתי מלקחות צורפים שוויצריות מס' 5’פינצטה	Miltex Inc.
מספרי קפיץ למיקרו-דיסקציה McPherson-Vannas, בעלי קצה חיתוך ישר 6 מ"מ	Roboz Surgical Instruments Co.
מד-סרט Helios
מיקרוסקופ dissection (מיקרוסקופ להשחלה)
מאיר בעוצמה גבוהה
המאסיטומטר (Hemacytometer)
כיבוי מבער בנזן
37°אינקובטור עם ניעור בטמפרטורת C
צנטריפוגה