Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

סיכום

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

תקציר

דג הזברה הוא מודל החיה פופולרי למחקר על התפתחות העין בגלל המהירה שלה

פרוטוקול

חלק 1: הכנות לפני microdissection

1. פתרונות
   1. E3 בינוני ⁴ (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl ₂ ו - 0.33 mM MgSO _4).
   2. הפתרון של הצלצול ^{1, 5} (116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 1.8 מ"מ CaCl _2, 5 HEPES מ"מ, pH7.2), מסנן מעוקרים.
   3. 5N NaOH.
2. כימית תחריט של מחטים טונגסטן
   1. Secure כוס קטן המכיל 5N NaOH על צלחת פטרי על ידי חימר.
   2. צרף מהדק נייר בצד של הכוס, כך הוא בא במגע עם הפתרון NaOH.
   3. חבר את האלקטרודה השלילית של אספקת מתח DC קליפ הנייר אלקטרודה חיובית בקצה אחד של קטע קצר (~ 2cm) של תיל טונגסטן.
   4. עוטפים את הקצה השני של החוט טונגסטן עם כדור חימר קטנים לטבול זה סוף לתוך הפתרון NaOH.
   5. הגדלת מתח 3V כ וטובלים את החוט למעלה ולמטה הפתרון NaOH עד שיעור תחריט טוב מושגת. מחט באיכות טובה בדרך כלל ניתן חקוק 10 דקות.
   6. תיל טונגסטן חשופים פתרון יהפוך בהדרגה רזה. כאשר כדור חימר נושר, הצד השני של הקו כי הוא עדיין מחובר האלקטרודה החיובית תהיה צורה מחט חדה.
   7. יש לשטוף את המחט חדה עם הפתרון של רינגר או E3 להסיר הפקדות מלח.
   8. צרף את המחט אל המוליך עץ על ידי קלטת או בעל מחט לטיפול קל.
3. תרבות צלחות
   1. פלקון 60 x 15 מ"מ לוחות קלקר תרבות מוכנים לשימוש עבור microdissection הרשתית.
   2. בשביל לנתח הרשתית המצורפת הרשתית, למעוך שני עוברים לחלוטין צלחת תרבות המכיל פתרון של רינגר להיפטר דביקות של המשטח 30 דקות לפני החיתוך. זמן קצר לפני הניתוח, לשטוף את הצלחת נרחב עם פתרון Ringer של טרי.
4. עוברים אוסף ובימוי
   1. דג הזברה למבוגרים נשמרים כפי שתואר ^{4, 5.}
   2. הפרד את הדגים הורה טנקים רבייה סטטי pairwise על ידי מחיצה בלילה שלפני הרבייה.
   3. הסר את המחיצה אחרי האור בחדר מופעלת למחרת בבוקר. לאפשר להורים לעבור אל במרווחים של 10 דקות כל חצי שעה. הפרד את הדג לאחר חציית כל אחד.
   4. שמירה על העוברים במעבר שנאספו כל מדיום E3 בנפרד 28 ° C.
   5. שלב בו עוברים הפריה שעות 10-12 פוסט (hpf) ו restage מיד לפני לנתיחה בנקודות זמן מסוימות, על פי הקריטריונים שנקבעו ^{1, 6.}

חלק 2: Dissection - הסרת המוח חשיפה עין ¹

• ההליכים המתוארים בסעיף זה נפוצים לנתח הרשתית (חלק 3A) ו הרשתית המצורפת הרשתית (חלק 3B).
• והניתוחים כל קנס נעשים על ידי קצה של מלקחיים דומון ובסיוע זוג נוסף של דומון מלקחיים עבור מיקום הרקמה. מחט כימי חרוט טונגסטן יכולה לשמש מניפולציות עדין במידת הצורך.
• והניתוחים כל קנס מבוצעות בהגדלה ~ 5-8x תחת מיקרוסקופ אולימפוס SZX16 מצויד אובייקטיבי 1X או שווה ערך.
• שמירה על העוברים בתווך E3 בשנת עליון ספסל החממה ב 28 ° C ליד המיקרוסקופ עבור גישה קלה העובר במהלך לנתיחה.
• שלב המיקרוסקופ הוא חימם עד 28 ° C על ידי צלחת תרמו כדי למזער את ההשפעה של תנודות הטמפרטורה על ביטוי גנים.

1. העברת עובר בשלב התפתחותי מסוים לפתרון של רינגר ב 60 פלקון X צלחת 15 מ"מ תרבות מוכנים כמתואר חלק 1 # 3.
2. חותכים את הראש עם החלק הקדמי של תא המטען במהירות מהגוף.
3. הצמד את הקצה האחורי של רקמה זו על הצלחת תרבות עם מלקחיים סיוע.
4. פתח את הראש בצד הגבי החל המצח הקדמי.
5. הסר את המוח, כך הצד המדיאלי של העיניים הוא חשוף פונה כלפי מעלה מניפולציות נוספות.

3A חלק: דיסקציה רשתית ¹

1. הכן את העובר כפי שמתואר חלק 2.
2. בזהירות המברשת הרשתית חשוף בצד המדיאלי של כדור העין פונה כלפי מעלה על ידי קצה מלקחיים עד פתח קטן על הרשתית נתפסת.
3. המשך צחצוח ומתקלף פעולה עד הצד המדיאלי של הרשתית כמעט חשוף לכל. הימנע מגרד ניקוב הרשתית חשוף.
4. כדי להסיר את הרשתית לרוחב על הרשתית אשר כעת פונים כלפי מטה, הגישה ולצחצח בזווית של כ -45 מעלות מעל פני צלחת תרבות.
5. הסר את הרשתית המצורף יחסית היטב serrata אורה ידי מצמיד את החלק המנותק של הרשתית אל גצלחת ulture לנתיחה, ואז להרים את הרשתית בעדינות.
6. מגלגלים את הרשתית בתחתית המנה תרבות לנקות את הרשתית שיורית.
   1. יש לנו לב תרבות המסוים הזה פלקון צלחת קלקר יש דבקות מועדף של הרשתית למשך כ 20 דקות פעם עובר הוא כתוש. מאפיין זה מנוצל להסרת שאריות הרשתית. עם זאת, תאים ברשתית לעשות מקל על פני השטח במידה פחותה יותר, אשר יכול להיבדק מקרוב בהגדלה גבוהה. צריך לאזן בין השלמות של הסרת הרשתית שלמות הרשתית.
   2. העדשה לעיתים קרובות שומרת על הצלחת תרבות מתנתק הרשתית במהלך תהליך מתגלגל. לעיתים, יש צורך לנתק את העדשה על ידי מחט טונגסטן חרוט עם פעולה מתערבל על פני העדשה.
7. נהלים אלה מצליח להסיר מן הרשתית הרשתית מבלי להתפשר על שלמות הרקמה. זה מסומן על ידי מורפולוגיה הכולל טוב (איור 1B ו 'ב') היסטולוגיה (איור 1B "), החץ בפרט, שימור תאי המטריצה ​​בין שכבת photoreceptor ואת הרשתית הוא טוב במיוחד (איור 1B."; להשוות עם היסטולוגיה מעובר כולה (איור 1 א ")).

3B חלק: הרשתית המצורפת לנתיחה רשתית ³

1. הכן את העובר כפי שמתואר חלק 2.
2. פין ראש לצלחת התרבות על ידי מלקחיים עוזר. הרם את העין בעדינות מהצד האחורי לרוחב ומגלגלים אל הצד הקדמי.
   1. דמית העין משוערת ורקמות scleral בצד החיצוני של השכבה הרשתית מחוברים בחוזקה יחסית לעור וניתן קלופים בעיקר על ידי גלגול את העין בזהירות בצד הקדמי.
3. מוציאים את העדשה עם מחט טונגסטן אחרי הצד לרוחב של העין חשופה וכאשר העין מחוברת עדיין העור.
4. נהלים אלה מצליח לשמר את השכבה הרשתית כולה עם הרשתית. Choroids משוערת ורקמות scleral ניתן להסיר במידה רבה (איור 1 ג, 'C ו-C ").

חלק 4: דגימת רקמות אוסף לעבודה RNA

1. הדגימות גזור ניתן לאסוף ב TRIzol בצינור RNase ללא microfuge לאפיון הזרם RNA כפי שתואר לפני ^1.

נציג תוצאות

באיור 1. (א) הרוחב (א ') להציג הגבי של ראש הזחל דג הזברה hpf בשעה 52 לפני לנתיחה. (א ') בסעיף היסטולוגית המקביל ראש הזחל ב (א) & (א'). (ב) הרוחב (ב ') להציג הגבי של הרשתית גזור hpf ב 54. פני הרשתית היה שלם משני צדדי ותצוגות הגבי. (ב ') סעיף היסטולוגית המקביל של הרשתית גזור ב (ב) & (ב'). מבנה הרשתית למינציה רשתית היה שלם. בפרט, מטריקס בין תאי השכבה ואת הרשתית קולטי האור (A ", חיצים) השתמרה היטב ברשתית גזור (B", חיצים). (ג) הרוחב (ג') להציג המדיאלי של הרשתית הרשתית המצורפת גזור hpf ב 52. הרשתית היא שכבה שלם ורצוף, אשר הצביעו גם על ידי בסעיף היסטולוגית של הרקמה גזור (C "). אזור לבן" C הוא עצב הראייה (חץ). לבדיקת רקמות, דגימות רקמה נאספו קבוע 4% paraformaldehyde. פלסטיק הטבעה וכן חתך של דגימות אלה בוצעו כמתואר ^3. בר סולם = 50 מיקרומטר.

דיון

Microdissection של רקמות דג הזברה עין יכול למעשה לקבל הרשתיות שלם הרשתית המצורפת הרשתיות. זו מסייעת באופן משמעותי מחקרים ביטוי הנוגעים רקמת עין ספציפיים (כלומר הרשתית הרשתית או). למעשה, יש לנו מנוצל בהצלחה הליכים אלה להשיג פרופילים ביטוי RNA של הרשתית כולה ¹ ו ³ הרשתית. השירות של פרופילים אלה נתמכת במידה רבה על ידי זיהוי האחרונות שלנו מסלולים למשפחות הגן, כי הם מודאגים ב בידול רשתית מוטציה ^2. השלבים הקריטיים ביותר בהליכים לנתיחה הרשתית הם פעולה צחצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מנוע עקה אלחוטי	VWR international	47747-370
ספק כוח DC	Lascar	PSU130	כל מקור מתח DC יעבוד. יהיה צורך באופטימיזציה נוספת עבור המתח הספציפי של מכשיר אחר.
עייך חד-פעמי &מבחנה זעירה (microtube), 1.5 מ"ל (נקייה מ-DNase, RNase ומפירוגנים)	VWR international	47747-366	אלה משמשים לאיסוף רקמות ב-TRIzol לצורך ניתוח ביטוי.
פינצטה Dumont #5, חודים: 0.05 x 0.01 מ"מ, Inox	World Precision Instruments, Inc.	500341	מימד קצה דק הוא רצוי אך אינו מחייב, שכן ייתכן שיהיה צורך להשחיז את הקצה מעת לעת.
פינצטה Dumont #5SF, חודים: 0.025 x 0.005 מ"מ, Inox	Fine Science Tools	11252-00	מימד קצה דק הוא רצוי אך אינו מחייב, שכן ייתכן שיהיה צורך להשחיז את הקצה מעת לעת.
צלחות תרבית פוליסטירן Falcon, ‏60 X 15 מ"מ	BD Biosciences	351007	לוחות אלו משמשים כלוחות נתיחה.
מיקרוסקופ סטריאו Olympus SZX16	Olympus Corporation	SZX16	כל סטראו-מיקרוסקופ יהיה יעיל. במחקרים קודמים השתמשנו בסטראו-מיקרוסקופ של Leica.1-3 ללא כל תקלות. אנו משתמשים בעדשת 1X בלבד עבור הניתוח, למרות שמותקנת לנו עדשת 2X.
אבן השחזה	Fine Science Tools	29008-01	השתמשו בכך כדי להשחיז את קצה הפינצטה במידת הצורך
פלטת חימום	טוקאי היט	MATS-U55SZX2B	זה משמש לשמירה על טמפרטורת הרקמה לאורך כל תהליך הנתיחה, ולהפחתת השפעת תנודות הטמפרטורה על ביטוי גנים. כמו כן, הנחנו את המיקרוסקופ כולו בחדר מבוקר סביבתית בטמפרטורה של 28 מעלות.°C במהלך נתיחה במחקרים קודמים1-3 בהצלחה רבה.
Trizol, 100 מ"ל	Invitrogen	15596-026
חוט טונגסטן, בקוטר 0.015 אינץ'	World Precision Instruments, Inc.	TGW1510
מקל Applicator מעץ	פוריטן	807	זה משמש להחזקת מחט טונגסטן שנחרטה כימית.