הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

28.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2053

⸱

29 ביולי 2010

 ,  , 
1Department of Biology, University of Virginia

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

תקציר

בתגובה במגוון ligands תאית, STAT (מתמר אותות activator של שעתוק) גורמי תעתוק מגויסים במהירות ממצב רדום בציטופלסמה שלהם על פני הקולטנים בתא שבו הם מופעלים על ידי זרחון על שיירי טירוזין יחיד 1. לאחר מכן הם dimerize ו translocate לגרעין לכונן שעתוק של גני מטרה, להשפיע, צמיחה בידול, הומאוסטזיס ואת התגובה החיסונית. באופן לא מפתיע, בהתחשב מעורבות נרחבת שלהם תהליכים בתא נורמלי, dysregulation של הפונקציה STAT תורם למחלות האדם, במיוחד סרטן מחלות אוטואימוניות 2 ו 3.

היא מבוססת היטב כי שעתוק מווסתת על ידי שינויים לתבנית הכרומטין 4,5. שינויים אלה כוללים את הפעילות של ה-ATP תלוי קומפלקסים, כמו גם השינויים היסטון קוולנטיים ו מתילציה בדנ"א 6. בגלל הפעלת STAT של ביטוי גנים הוא גם מהיר חולף, זה דורש מנגנונים ספציפיים עבור התבנית ויסות הכרומטין ב STAT תלויי לוקוסים גן. כדי להגדיר מנגנונים אלה, אנו לאפיין את השינויים היסטון והפעילות האנזימטית שיוצרים אותם לוקוסים גן להגיב איתות STAT. פרוטוקול זה מתאר הכרומטין immunoprecipitation, שיטה כי הוא בעל ערך לחקר STAT איתות הכרומטין ביטוי גנים מופעלים.

פרוטוקול

תכנון

יום לפני ניסוי השבב המתוכנן, התאים צריכים להיות מתורבת, כך מספר מספיק זמין. נניח כי כל CHIP assay ידרוש ~ 1-1.5 7 x 10 תאים. תמיד מתכנן לעשות הן שליליות (IgG) חיובי (נוגדן היסטון מחבת) בקרות ניסויים כפולים.
עצה - עבור תאים 2FTGH, כל CHIP assay דורש על אחד 15 ס"מ צלחת רקמה תרבות ב 80% confluency.

חלק 1: הכנת הכרומטין ולבצע CHIP

  1. הסר מדיה התרבות לגרום לתאים של פעמים נדרש עם 20 מ"ל של 10% קוסמי עגל בסרום (CCS) / DMEM המכיל IFN-gamma ב 5 ng / mL. החלף את המדיה על צלחות uninduced עם 20 מ"ל של 10% CCS / DMEM גם כן.
  2. במנדף קטר, להוסיף 540 פורמלדהיד 37% μL כדי 20 מ"ל של התקשורת (הריכוז הסופי 1%) בצלחת 15 ס"מ.
    עצה - צלחת הטיה להוסיף את פורמלדהיד לבריכה מדיה - אז הצלחת רוק להפיץ אותו באופן שווה.
  3. אפשר crosslinking להמשיך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הוסף גליצין ריכוז M 0.125 הסופי להפסיק crosslinking.
  5. לשאוב אבק התקשורת לשטוף תאים פעם עם פוספט 10 מ"ל קרח קר בופר סליין (PBS).
  6. איסוף תאים עם מגרד תא ~ 7 מ"ל PBS ולשלב תאים (מתוך 6 לוחות), אשר טופלו זהים שפופרת 50 מ"ל חרוטי על הקרח.
  7. צנטריפוגה (Beckman Coutler אלגרה 12-R צנטריפוגה) בסל"ד 1800 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לשאוב PBS.
    עצה - הצמד להקפיא את התא גלולה אם לעצור פה חנות ב -80 ° C.
  8. Resuspend התא גלולה ב הצפת 4 מ"ל נפיחות (25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 מ"מ MgCl 2, 10 mM KCl, 0.1% NP40. DTT הוסף 1 מ"מ, מעכבי פרוטאז השלם ומקררים על קרח לפני השימוש) והעברת 15 מ"ל חרוטי צינור.
    עצה - זה נפח המאגר נפיחות מתאים 6 צלחת איגום (~ 6-9 x 10 7 תאים). חיץ פחות או יותר יכול לשנות את יעילות douncing.
  9. לדגור על השעיית התא על קרח במשך 10 דקות.
  10. העברת השעיה ל טרום מקורר 15 מ"ל douncer (ויטון) ו dounce 20 משיכות עם העלי א
  11. העברת dounced תאים חזרה צינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
  12. צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 5 דקות ב 4 ° C ו להתעלמות supernatant.
  13. Resuspend גלולה גרעיני (~ 200 μL מ 6 צלחות) ב 3 מ"ל (15 כרכים גלולה) של הצפת Sonication (50 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, deoxycholate נתרן 0.1%, 0.1% SDS. הוסף מעכבי פרוטאז השלם ומקררים על קרח רק לפני השימוש).
    עצה - זה נפח המאגר sonication מתאים 6 צלחת איגום (~ 6-9 x 10 7 תאים). חיץ פחות או יותר יכול לשנות את יעילות sonication.
  14. Sonicate ההשעיה גרעינים על קרח במשך 10 מחזורים (20 שניות on/40 שניות את / משרעת ההגדרה של 8) באמצעות Sonicator Misonix 3000 מצויד microtip. זה בדרך כלל התוצאות שברי הכרומטין בממוצע 200-1000 bps בגודל.
    טיפ - מכיוון sonicators ישתנו, את היעילות sonication צריכה להיקבע באופן אמפירי. כדי לעשות זאת, לקחת aliquots של μL 20 sonication לפני ואחרי כל מחזור sonication. מחממים אלה דגימות 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. הוסף חוצץ טעינת ה-DNA ולהפעיל תקן 1% agarose / TBE ג'ל לדמיין שברי DNA).
  15. העברת sonicated חומר צינור SS34 צנטריפוגה צנטריפוגה ו 20 דקות ב 4 ° C בסל"ד 13000 ב הרוטור SS34 (Sorvall RC6 פלוס צנטריפוגה) כדי גלולה מה הוא בדרך כלל כמות קטנה של פסולת התא.
  16. בזהירות כדי להעביר את supernatant צינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
  17. מראש ברור ידי הוספת הזרע 360 μL סלמון DNA / או חלבון G slurry agarose חרוזים נדנדה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
    עצה - צעד זה מקטין את הרעש assay העולה מן הלא ספציפית אירועים מחייב.
  18. צנטריפוגה בסל"ד 1000 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות גלולה חרוזים agarose.
  19. העברת מראש פינה supernatant אל צינור אחר חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
  20. מדוד את A260 יחידות של הכרומטין מראש פינה את ולהתאים את עוצמת הקול עם הצפת Sonication עד ארבע (4) A260 יחידות (0.2 מ"ג / מ"ל ​​בהנחה A260 1 יחידה = 0.050 מ"ג / מ"ל)
    עצה - כדי למדוד את A260 יחידות, לדלל 10 μL של הכרומטין מראש פינה ב 190 DDW μL; ספקטרופוטומטר ריק עם חיץ 10 sonication μL ב DDW μL 190.
  21. שמור 75 μL של הכרומטין (ב A260 4 יחידות), כמו לדוגמא קלט ולאחסן ב 20 ° C עד מוכן להפוך crosslinks.
    עצה - שלב זה הוא קריטי לניתוח נתונים. אל תשכחי לקחת את aliquot קלט.
  22. Aliquot הכרומטין מוכנים 1.7 צינורות microfuge מ"ל על ice כמו aliquots 1 מ"ל.
    עצה - אם לעצור כאן, הצמד להקפיא את הכרומטין מוכן על קרח יבש חנות ב -80 ° C. נ.ב.: הכרומטין מאוחסנים יכול להשפיל, ייצור פחות תוצאות אופטימליות, כך להימנע במידת האפשר.
  23. מוסיפים את שבב כיתה נוגדנים דגימות המושרה ואת uninduced סטים כפולים. הוסף IgG (2 מיקרוגרם) והפאן היסטון H3 נוגדן (15 μL) כמו שולט שלילי וחיובי על קבוצות דגימות המושרה ואת uninduced.
    עצה - כמות הנוגדנים להשתמש צריכה להיקבע באופן אמפירי או לראות גיליון מוצר של הספק בסכומים שהציע. בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם של הנוגדן שבב ציון עובד היטב. הכרך המתאים צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור נוגדנים מסופקים כמו בסרום.
  24. רוק כל צינורות לילה בשעה 4 ° C.

חלק 2: אוספים IMMUNOCOMPLEXES

  1. הוסף 60 μL של זרע סלמון דנ"א / חלבון או חלבון G slurry חרוזים agarose לכל הצינורות.
    השתמש חלבון עצה עבור נוגדנים polyclonal ארנב חלבון G עבור נוגדנים חד שבטיים העכבר.
  2. רוק בבית 4 ° C למשך לפחות 60 דקות.
  3. גלולה immunocomplexes (חרוזים agarose) על ידי microfuging בעדינות בסל"ד 2000 על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  4. לשאוב supernatant.
  5. שטפו את immunocomplexes עם 1 מ"ל של כל אחד Buffers לשטוף הבאים במשך 10 דקות עם נדנדה ב 4 ° C. Microfuge 3 דקות בסל"ד 2000 ב 4 ° C בין לשטוף כל לשאוב supernatant. שמור דגימות מקורר על הקרח. הוסף PMSF רק לפני השימוש.
    • מלח לשטוף נמוכה - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
    • מלח לשטוף גבוהה - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
    • LiCl שטפי - 0.25 מ LiCl, 1% NP-40, deoxycholate סודיום 1%, 1 mM EDTA, 10 mM טריס-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF
    • TE שטפי - שני רוחצת עם TE הצפת -10 mM טריס-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
  6. הסר את הצפת לשטוף הסופי TE ואל חרוזים, להוסיף 500 הצפת elution μL (50 mM טריס-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, SDS 1%).
    עצה - הצפת elution צריך להיות מוכן טרי.
  7. וורטקס לערבב חרוזים agarose ב הצפת elution וחום במשך 30 דקות על 65 ° C.
    עצה - מערבולת כל צינור לפחות כל 10 דקות במהלך זה 30 דקות.
  8. Microfuge למשך 30 שניות ב 2000 סל"ד ולהעביר את eluent לצינור microfuge חדש.
    טיפ - במהלך elution, להפשיר דוגמאות קלט ולהוסיף 500 הצפת elution μL לכל אחד. כלול דגימות אלה בכל הצעדים הולך קדימה.
  9. הוסף 5 M NaCl לריכוז סופי של 200 מ"מ לכל דגימות מערבולת.
  10. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה (או לפחות 4 שעות).

חלק 3: ChIP'd לטהר DNA INPUT

  1. Microfuge כל הדגימות למשך 30 שניות כדי לאסוף עיבוי על העפעפיים.
  2. הוסף 1μL של RNAse (10 U / μL) אל צינור כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  3. הוסף 10 μL 0.5 M EDTA, 40 μL 0.5 M-Cl טריס pH 6.5, 2 μL proteinase K (10 מ"ג / מ"ל) ו לדגור על 45 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. עצה הכינו תערובת אמן ריאגנטים אלה ולהוסיף 52 μL על צינור אחד.
  4. פנול / כלורופורם / isoamyl לחלץ אלכוהול ולאחר מכן כלורופורם / isoamyl אלכוהול לחלץ את הדגימות.
  5. הוסף 2 הגליקוגן μL (25 מיקרוגרם / μL) ו 0.1 כרכים של pH Na Acetate 3M 5.2 ו מערבולת.
  6. הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול ו מערבולת.
  7. לדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

חלק 4: ChIP'd לטהר DNA INPUT המשך

  1. דגימות Microfuge עבור מינימום של 20 דקות 13,000 סל"ד ב 4 ° C כדי להאיץ את ה-DNA / גליקוגן כדורי.
  2. לשטוף עם DNA / גליקוגן כדורי עם 1 מ"ל של אתנול 70%.
  3. האוויר יבש או יבש את כדורי במהירות בצנטריפוגה DNA סאוואנט ואקום מהירות.
    עצה - אל על יבש את ה-DNA.
  4. Resuspend DNA / גליקוגן כדוריות בתוך מאגר TE 200 μL.
  5. DNA (1 μL) מוכן כימות באמצעות PCR בזמן אמת. חנות ה-DNA שנותרו ב 20 ° C.
    עצה - שימוש יותר מ 1 μL של DNA יכולים לעכב את התגובות בזמן אמת PCR, כך הסולם בזהירות.

חלק 5: תוצאות נציג:

שבב קלט דגימות DNA הם לכמת עם Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR המערכת) באמצעות פריימרים ספציפיים מוקד הגן של עניין. Primers כי היעד רצף גנומי ידוע להיות מועשר או חסר את השינויים היסטון להיות assayed יכול לשמש בקרות חיוביות ושליליות גם כן. נתונים מוצג כאחוז קלט. ההליך CHIP צריך להיות לגמרי repeated עם שלושה ביולוגיים משכפל כדי להבטיח שינויים דווח שינויים היסטון הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

ישנם נושאים חשובים שיש להביא בחשבון בעת ​​שימוש בזמן אמת PCR לכמת DNA, כולל עיצוב פריימר, יעילות ה-PCR, ואת הדרך המתאימה כדי לחשב את אחוז נהלים קלט ונורמליזציה. כאשר פרופיל התפוסה שינוי היסטון ברחבי הגן, את יעילות ה-PCR חייב להיות עקבי בין כל זוגות פריימר. יצרן בזמן אמת, מערכת ה-PCR יכולה לספק את המידע האימונים הדרושים.

איור 1 מציג תוצאות נציג של הכרומטין immunoprecipitated במהלך ההפעלה של הגן STAT1 IRF1 9, מופעלות על ידי IFN-γ.

איור 1
באיור 1. תפוסה של STAT1, RNA פולימראז II ו H3K36me3 היא דינמית במהלך ההפעלה של הגן STAT1 IRF1. (A, B, C) ​​שבב עם α-H3K36me3, α-STAT1 ו α-Pol II של הכרומטין שנאספו תאים 2FTGH המושרה עם IFN-γ במשך 30 דקות (ריבועים אדומים), 1.5 שעות (עיגולים כחולים), 5 שעות ( משולשים ירוקים) או uninduced (יהלומים שחורים). IgG הוא שליטה שלילי (אפור חוצה). (ד) פאן H3 הוא שליטה חיובית ומראה את התפוסה היסטון מול מוקד ב (עיגולים כחולים) המושרה ותנאי uninduced (יהלומים שחורים). לטבול סביב נ"ב -5 בשל דלדול הנוקלאוזום שנמצא באתרים להתחיל שעתוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול שבב התווה שימש בהצלחה במעבדה כדי assay יותר מעשרים שינויים היסטון אחרת. בנוסף, יש לנו מאופיין בשינויים התפוסה של גורמי שעתוק, היסטון, שינוי אנזימים, חלבונים המזהים שינויים היסטון ואת השנייה RNA פולימראז מכונות שעתוק, בכמה IFN-γ גנים המושרה. השתמשנו גם את ההליך כדי לאפיין שינויים שינויים היסטון במהלך התמיינות של תא סרטני גזע 10.

איכות נתונים CHIP בסופו של דבר תלויה האפקטיביות של הנוגדן משמש ויש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת וירג'יניה, אוניברסיטת וירג'יניה Cancer Center ו פ תומאס קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון. אנו מודים E. ג'יימס דרנל מעבדה (אוניברסיטת רוקפלר) רוס רוברט לאב (אוניברסיטת פורדהם) של שורות תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פורמלדהיד 37%Fisher ScientificBP531-500
כלורופורם/איסואמיל אלכוהולAcros OrganicsAC32715-5000
מעכבי פרוטאז מיני מלאיםקבוצת Roche1836153
סרום עגלים קוסמיHycloneSH30087.04N
DMEMHycloneSH30243
DTTSigma-AldrichD0632
EDTAFisher ScientificBP118-500
אתנולPharmco Products, Inc.zp1110EP
גליציןקבוצת Roche100149
גליקוגןקבוצת Roche901393
HEPESSigma-AldrichH3784
IFN-gammaR&D Systems285-IF-100
IgGJackson ImmunoResearch109-005-003
KClMP Biomedicals
LiClSigma-AldrichL4408
MgCl22Sigma-AldrichM8266
נתרן אצטטFisher ScientificBP333-500
מלח נתרן של חומצה דאוקסיכוליתFisher ScientificBP349-100
NaClFisher Scientific7647-14-5
NP40US BiologicalN3500
Anti-Histone H3, CT, panEMD Millipore07-690
פנול/כלורופורם/איזואמילFisher Scientific108-95-2
סלקיין פוספט מרוכז (Phosphate Buffered Saline)Fisher Scientific7647-14-5
PMSFEMD Millipore50-230-0316
פרוטאינז K (Proteinase K)5 PRIME2500140
RNAse A5 PRIME2500130
אגרוז DNA מזרה של סלמון/פרוטאין AEMD Millipore16-157
אגרוז עם DNA מזרה של סלמון/Protein GEMD Millipore16-201
SDSFisher ScientificBP166-500
Tris-ClSigma-AldrichT5941
Triton X-100Acros Organics327372500
Anti-K36me3Abcamab9050
Anti-STAT1Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-345X
נוגדן נגד RNA פולימראז IISanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-899

מקורות

  1. Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
  2. Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
  3. Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
  4. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  5. Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
  8. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
  9. Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
  10. Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

STATCross linkingDNAPCRInput
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.