פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתגובה במגוון ligands תאית, STAT (מתמר אותות activator של שעתוק) גורמי תעתוק מגויסים במהירות ממצב רדום בציטופלסמה שלהם על פני הקולטנים בתא שבו הם מופעלים על ידי זרחון על שיירי טירוזין יחיד 1. לאחר מכן הם dimerize ו translocate לגרעין לכונן שעתוק של גני מטרה, להשפיע, צמיחה בידול, הומאוסטזיס ואת התגובה החיסונית. באופן לא מפתיע, בהתחשב מעורבות נרחבת שלהם תהליכים בתא נורמלי, dysregulation של הפונקציה STAT תורם למחלות האדם, במיוחד סרטן מחלות אוטואימוניות 2 ו 3.
היא מבוססת היטב כי שעתוק מווסתת על ידי שינויים לתבנית הכרומטין 4,5. שינויים אלה כוללים את הפעילות של ה-ATP תלוי קומפלקסים, כמו גם השינויים היסטון קוולנטיים ו מתילציה בדנ"א 6. בגלל הפעלת STAT של ביטוי גנים הוא גם מהיר חולף, זה דורש מנגנונים ספציפיים עבור התבנית ויסות הכרומטין ב STAT תלויי לוקוסים גן. כדי להגדיר מנגנונים אלה, אנו לאפיין את השינויים היסטון והפעילות האנזימטית שיוצרים אותם לוקוסים גן להגיב איתות STAT. פרוטוקול זה מתאר הכרומטין immunoprecipitation, שיטה כי הוא בעל ערך לחקר STAT איתות הכרומטין ביטוי גנים מופעלים.
פרוטוקול
תכנון
יום לפני ניסוי השבב המתוכנן, התאים צריכים להיות מתורבת, כך מספר מספיק זמין. נניח כי כל CHIP assay ידרוש ~ 1-1.5 7 x 10 תאים. תמיד מתכנן לעשות הן שליליות (IgG) חיובי (נוגדן היסטון מחבת) בקרות ניסויים כפולים.
עצה - עבור תאים 2FTGH, כל CHIP assay דורש על אחד 15 ס"מ צלחת רקמה תרבות ב 80% confluency.
חלק 1: הכנת הכרומטין ולבצע CHIP
- הסר מדיה התרבות לגרום לתאים של פעמים נדר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול שבב התווה שימש בהצלחה במעבדה כדי assay יותר מעשרים שינויים היסטון אחרת. בנוסף, יש לנו מאופיין בשינויים התפוסה של גורמי שעתוק, היסטון, שינוי אנזימים, חלבונים המזהים שינויים היסטון ואת השנייה RNA פולימראז מכונות שעתוק, בכמה IFN-γ גנים המושרה. השתמשנו גם את ההליך כדי לאפיין שינויים שינויים היסטון במהלך התמיינות של תא סרטני גזע 10.
איכות נתונים CHIP בסופו של דבר תלויה האפקטיביות של הנוגדן משמש ויש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת וירג'יניה, אוניברסיטת וירג'יניה Cancer Center ו פ תומאס קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון. אנו מודים E. ג'יימס דרנל מעבדה (אוניברסיטת רוקפלר) רוס רוברט לאב (אוניברסיטת פורדהם) של שורות תאים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פורמלדהיד 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| כלורופורם/איסואמיל אלכוהול | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| מעכבי פרוטאז מיני מלאים | קבוצת Roche | 1836153 | |
| סרום עגלים קוסמי | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| אתנול | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| גליצין | קבוצת Roche | 100149 | |
| גליקוגן | קבוצת Roche | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl22 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| נתרן אצטט | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| מלח נתרן של חומצה דאוקסיכולית | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| פנול/כלורופורם/איזואמיל | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| סלקיין פוספט מרוכז (Phosphate Buffered Saline) | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| פרוטאינז K (Proteinase K) | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| אגרוז DNA מזרה של סלמון/פרוטאין A | EMD Millipore | 16-157 | |
| אגרוז עם DNA מזרה של סלמון/Protein G | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| נוגדן נגד RNA פולימראז II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
מקורות
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
