כדי לבחון ביטוי גנים ברקמות הזרוע גלמי של Bicyclus anynana, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה של הכלאות באתרו באמצעות riboprobes. כמו כן אנו מספקים הנחיות אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול זה לשימוש כנפיים גלמי Lepidopteran של מינים אחרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן אנו מציגים, בפורמט וידיאו, פרוטוקול של הכלאות באתרם גלמי כנפיים של פרפר Bicyclus anynana באמצעות riboprobes. ב הכלאות באתרו, עמוד התווך של הביולוגיה ההתפתחותית, מועילים כדי ללמוד את דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בפיתוח רקמות ברמה של שעתוק. אם נוגדנים היעד מוצרי חלבון של שעתוק הגנים טרם פותחו, ו / או יש גן עותקים מרובים של חלבון מסוים בגנום זה לא יכול להיות מובחן באמצעות נוגדנים זמינים, בכל מנח יכול לשמש במקום. בעוד בטכניקה באתרו עבור דיסקים כנף הזחל כבר זמין לקהילה פרפר במשך כמה שנים, פרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה עבור כנפי גלמי גדול יותר ועדין יותר.
פרוטוקול
יום 1
- הכן את הפתרונות הבאים:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- הוסף DEPC עבור הנפח הכולל 0.1% ולנער פתרונות במרץ.
- החיטוי.
- Paraformaldehyde תקן 4% - באמצעות PBS-DEPC
- פתרון proteinase K - אם המשקע קיים, מערבולת במרץ לפני הסרת aliquot
- עצור הצפת עיכול
- Prehybridization הצפת
- 50:50 PBT: מאגר Prehybridization
- הכלאה הצפת
- פתרונות צריך להישמר RNase חינם. שימוש או כלי זכוכית, כי כבר אפוי (4 שעות 250 ° C) או פלסטיק חד פעמיות. Pipettes סרולוגית הם מאוד שימושי עבור ממציא פתרונות
- לנתח כנפיים מעת-מבוים גלמים ב PBS
- העבר כנפיים ישירות תקן הצפת בבארות של צלחת 24 תרבות היטב בטמפרטורת החדר
- תקן תקליטורי למשך 2 שעות
- לשטוף 5 x 5 דקות PBT
- דגירה כנפיים במשך 3 דקות בתמיסה K proteinase
- לשטוף 2 x ב הצפת עצור עיכול
- לשטוף 5 x 5 דקות PBT
- לשטוף 2 x 5 דקות 50:50 PBT: PHB
- שטפי 1 x 10 דקות PHB
- דגירה שעה לפחות 1 PHB על 55 ° C.
- חום לפגל RNA בדיקה (20-50ng לכל צורך היטב) (80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) ולהוסיף למאגר הכלאה (100 μl הדרוש לכל טוב)
- הוספת בדיקה בארות דגירה 48 שעות ב 55 ° C
יום 3
- שטפי 4 x 5 דקות 55 ° C PHB
- דגירה לילה PHB ב 55 ° C
יום 4
- הכן את הפתרונות הבאים:
- בלוק נוגדן הצפת
- שטפי 1 x 5 דקות 50:50 PBT: PHB
- שטפי 4 x 5 דקות PBT
- כנפיים דגירה במשך שעה 1 ב הצפת בלוק ב 4 ° C
- דגירה כנפיים בדילול 1:2000 של נוגדנים נגד Dig לילה ב 4 ° C
יום 5
- הכן את הפתרונות הבאים:
- איתור הצפת
- פיתוח הפתרון - (לעטוף בנייר כסף) אור רגיש
- לשטוף 3 x 5 דקות PBT בטמפרטורת החדר
- לשטוף 7 X 5 דקות PBT
- לשטוף כנפיים פעמיים בתוך מאגר זיהוי
- פיתוח הכנפיים מ"ל 1 של פיתוח פתרון - זמן של התפתחות צריך להיות במעקב כל הזמן - פעמים מתפתחות יכול לשנות אפילו בעת שימוש חלליות אותו פתרון פיתוח - בדרך כלל לבדוק אחרי 5-10 דקות ולאחר מכן להגדיל את מרווחי עד לילה. פלייט יש לעטוף בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור כאשר לא בדיקת דגימות.
- לשטוף חמש פעמים הצפת עצור פיתוח
- הר כנפיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אופטימיזציה של הפרוטוקולים הקיימים
ב הכלאות באתרם על דיסקים כנף הזחל בוצעו בהצלחה באמצעות דיסקים של פרפרים תמצית coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. ותרבי et al 1999).. הפרוטוקול הנוכחי הותאם מתוך פרוטוקול כתוב מפורט זמין על פי דרישה מן המעבדה קרול עבור stainings כנף הזחל. השינויים שעשינו לשרת כדי להכיל הבדלים בין רקמות כנף הזחל ו גלמי. במהלך והניתוחים hindwing גלמי, קרום peripodial יש להסיר ולא נכלל הבארות. הזמן לתקן הראשוני הוא הרבה יותר בפר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים ג'יין Selegue, מרגרט הולינגסוורת', ג'ין ברי, ריו Futahashi, Najmus סהר מחפוז, אלכסנדר Popadic, בוב ריד, תמיכה טכנית עבור רוש לסייע לפתרון בעיות בפרוטוקול זה. אנו מודים גם ויליאם Piel עצה על עריכת הסרט.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| תמיפת קיבוע | 4% פאראפורמאלדהיד ב-PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 ב-PBS | |||
| תמיסת Proteinase K | 2.5mג'/מ"ל Proteinase K ב-PBT | |||
| בופר לעצירת העיכול | 2 מ"ג/מ"ל גליצין ב-PBT | |||
| בופר טרום-היברידיזציה | עבור 50 מ"ל PHB: 12 מ"ל מים שעובדו ב-DEPC + 25 מ"ל פורממיד (Formamide) + 12.5 מ"ל SSC בריכוז 20x + 50 מיקרוליטר Tween 20 + 500 מיקרוליטר DNA מזרה סלמון בריכוז 10 מ"ג/מ"ל (ללא RNase, עבר דנטורציה תרמית לפני ההוספה לתמיסה). | |||
| תמיסת דיברידיזציה (Hybridization Buffer) | הוסף גליקוגן בריכוז 1 מ"ג/מ"ל לתמיסת טרום-הibrדיזציה (prehybridization buffer) | |||
| בופר חסימה | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | נוגדן | קבוצת Roche | 11 093 274 910 | אלקלאין פוספטאז מצומד |
| סט תמיסות שטיפה וחסימה ל-DIG | קבוצת Roche | 11 585 762 001 | ||
| תוכנית קיבוע מימית Crystal Mount | Sigma-Aldrich | C0612 | תוכנית הרכבה (Mounting Medium) |
מקורות
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
