שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

Summary

ההשפעה של קשיחות מתחת לקרקע על התפקוד התאי יכול להיות המודל במבחנה באמצעות הידרוג polyacrylamide של התאמות שונות.

Abstract

רקמות קשיחות הוא הקובע חשוב של תפקוד הסלולרי, ושינויים רקמות נוקשות קשורות כלל בסרטן פיברוזיס, ומחלות לב וכלי דם ^1-11. גישות מסורתיות תא ביולוגי ללימוד פונקציה הסלולר לערב תאים culturing על תשתית נוקשה (צלחות פלסטיק או זכוכית coverslips) אשר אינו יכול להסביר את ההשפעה של ECM אלסטי או וריאציות קשיחות ECM בין רקמות. מודל in vivo ציות התנאים רקמה במבחנה, אנו ואחרים להשתמש ECM מצופה הידרוג. במעבדה שלנו, הידרוג מבוססים על polyacrylamide אשר יכול לחקות את טווח התאמות רקמה ביולוגית לראות ^12. "תגובתי" תלושי לכסות מופקים על ידי הדגירה עם NaOH ואחריו תוספת של 3-APTMS. Glutaraldehyde משמש צולבות הקישור 3-APTMS ואת ג'ל polyacrylamide. הפתרון של acrylamide (AC), bis-acrylamide (BIS-AC) ו persulfate אמוניום משמש פילמור של הידרוג. N-hydroxysuccinimide (NHS) הוא שולב פתרון ה-AC חלבון ECM crosslink כדי הידרוג. לאחר פילמור של הידרוג, משטח ג'ל מצופה חלבון ECM של בחירה כגון, קולגן פיברונקטין, vitronectin וכו '

קשיחות של הידרוג ניתן לקבוע על ידי rheology או במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ובניכוי ידי שינוי אחוז AC ו / או bis-AC בפתרון ^12. באופן זה, נוקשות תשתית ניתן להתאים קשיות של רקמות ביולוגיות אשר ניתן לכמת באמצעות rheology או AFM. תאים אז יכול להיות seeded על אלה הידרוג ותרבותיים בהתבסס על תנאי הניסוי הנדרש. הדמיה של התאים והתאוששות שלהם לניתוח מולקולרית היא פשוטה. במאמר זה, אנו מגדירים לקרקע רך כמו אלה שיש moduli אלסטי (E) <3000 פסקל לקרקע נוקשה / רקמות אלה עם E> 20,000 פסקל.

Protocol

הכנה

• Coverslips צריך להיות autoclaved.
• מים מזוקקים או deionized ועיקור יש להשתמש כדי להכין פתרונות עבור coverslips כביסה.
• AC (40% w / v) bis-AC (1% w / v) פתרונות עיקור על ידי סינון 0.2 מיקרומטר. הכן persulfate אמוניום 10% (APS; מים 100μg/ml) זמן קצר לפני השימוש לסנן סטרילית. החלף את הפתרון APS חודשי.
• ריאגנטים כימיים כגון 3-APTMS, כלורופורם, glutaradehyde, NHS, ו SurfaSil שלא ניתן autoclaved....

Discussion

מרכיב חיוני של תהליך פילמור הידרוג הוא להימנע היווצרות בועת אוויר אשר יאפשר תאים להיקשר coverslip הזכוכית ולא הידרוג ECM מצופה עצמו. זה ניתן למנוע על ידי בקפידה pipetting הפתרון פילמור לאחר vortexing ו חזותית ולוודא כי אין בועות אוויר הפכו לכוד בתוך הג'ל. אנחנו תמיד ממליצים על הכנת נוסף "תגובתי" coverslips ו הידרוג כדי להבטיח שיש מספיק לניסויים.

תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם בכל פעם ג'לים נשט.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
גלוטרלדהיד, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	חנות ב-20° C
3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%)	Sigma-Aldrich	281778	אחסן בטמפרטורת החדר
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	חנות בטמפרטורת החדר
NHS (N-hydroxysucinimide Ester)	חנות Sigma-Aldrich	A-8060	ב-4° C החלף
אלבומין חודשי, סרום בקר, למעשה ללא חומצות שומן	Sigma-Aldrich	A6003-100G	חנות ב-4° C
Coverslips (25 מ"מ)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Coverslips (18 מ"מ)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D