בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים את הביטוי, solubilization, וטיהור של חלבון קרום הביע recombinantly, MexB, כפי מורכב חלבון מסיס חומר ניקוי. MexB היא התנגדות הממברנה multidrug טרנספורטר מן החיידק Pseudomonas aeruginosa אופורטוניסטית הפתוגן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug
במאמר זה
סיכום
תקציר
התנגדות Multidrug (MDR), היכולת של תא סרטני או פתוגן להיות עמידים בפני מגוון רחב של תרופות נוגדות סרטן מבנית או תפקודית ואינו קשור אנטיביוטיקה, היא בעיה רצינית הנוכחי בריאות הציבור. זו התנגדות multidrug נובע במידה רבה אנרגיה תלויי משאבות בזרימת סמים. המשאבות לגרש תרופות נוגדות סרטן או אנטיביוטיקה לתוך המדיום חיצוניים, הורדת ריכוז תאיים שלהם מתחת לסף רעילים. אנחנו לומדים התנגדות multidrug ב Pseudomonas aeruginosa, פתוגן חיידקי אופורטוניסטית שגורם לזיהומים בחולים עם סוגים רבים של פציעה או מחלה, למשל, כוויות או סיסטיק פיברוזיס, וגם חיסונית נפגעת דיאליזה סרטן, חולים להשתלה. בזרימת הגדולות MDR משאבות פ aeruginosa הם קומפלקסים משולשת המורכבת antiporter הפנימית הממברנה פרוטונים סמים (RND), ערוץ הממברנה החיצונית (OMF), לבין חלבון מקשר periplasmic (MFP) 1-8. החלבונים RND ו OMF הם חלבונים הטרנסממברני. חלבונים הטרנסממברני לפצות יותר מאשר 30% של כל החלבונים הם 65% מטרות תרופה הנוכחי. תחומים הטרנסממברני הידרופובי לייצר חלבונים מסיסים חיץ מימית. לפני חלבון הטרנסממברני יכול להיות מטוהרים, יש צורך למצוא את התנאים חוצץ המכיל חומר ניקוי עדין המאפשרים את החלבון להיות solubilized כמתחם אבקת חלבון (PDC) 11/09. בדוגמה זו, אנו משתמשים חלבון RND, פ MexB aeruginosa טרנספורטר הטרנסממברני, כדי להדגים איך לבטא צורה רקומביננטי של חלבון הטרנסממברני, solubilize אותו באמצעות דטרגנטים, ולאחר מכן לטהר את אבקת קומפלקסים חלבונים. שיטה זו בכלל ניתן ליישם את הביטוי, טיהור, ו solubilization של חלבונים רבים אחרים קרום הביע recombinantly. ניקוי קומפלקסים חלבונים יכול מאוחר יותר לשמש אפיון ביוכימי או biophysical לרבות קביעת רנטגן קריסטל מבנה או מחקרים crosslinking.
פרוטוקול
1. יום 1:
MexB מ Pseudomonas aeruginosa מקודד על ידי pFB101. הגן MexB הוגדל מ - פ aeruginosa DNA הגנומי ונוסף על NdeI ואתרי XhoI הגבלה של + pET30b וקטור. לבנות מכיל תג בטרמינל C-hexahistidine.
- פלסמיד משמש כדי להפוך את ה coli זן C43 (DE3) 12, ואת transformants הם מצופה על אגר LB המכיל 30 UG / mL kanamycin.
2. יום 2: תרבויות לינה:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בנוסף multidrug, התנגדות פעילויות רבות הסלולר חיוניים, כולל תחבורה ותקשורת יון תאים תאים, תחבורה, שלפוחית, תחזוקה של המבנה התאי, והוא מארח הפתוגן אינטראקציות, לערב חלבונים אשר מוטבעות בתוך קרום התא. חלבונים הטרנסממברני לפצות מעל 30% של חלבונים ידועים הם מטרות עבור רוב התרופות בשימוש כיום. קיפול לא נכון או פעילות של חלבונים הטרנסממברני להוביל מחלות גנטיות חשובות, כולל סיסטיק פיברוזיס סוכרת ו. למרות החשיבות העצומה של חלבונים הטרנסממברני, יש הרבה פחות ידוע על המבנים שלהם ואת המנגנוני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
פרויקט זה נתמך על ידי מענקים CJJ מן הקרן הלאומית למדע והחברה למדעים Biomolecular.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| באפר לדגימות SDS | Bio-Rad | 161-0737 | |
| זן *E. coli* C43(DE3) | Lucigen | 60345-1 | |
| קנמיצין סולפט | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| מצע 2XYT | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| מצע LB | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNaseI | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| ליזוזים | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| טבליות מעכבי פרוטאזה שלמות ללא EDTA | קבוצת Roche | 11 873 580 001 | |
| NaP חד-בסיסי | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP דו-בסיסי | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl₂2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| גליצרין | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| <מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM)>נ-דודציל-βD-מלטופירנוזיד- | Anatrace | D310 | |
| מבחנות 15 מ"ל | Corning | 430052 | |
| רוקר מסוג נדנדה (See-Saw Rocker) | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| שרף זיקה למתכת Talon | Clontech Laboratories | 635503 | |
| אימידזול | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| ג'לי SDS-PAGE פוליאקרילאמיד 10% | Bio-Rad | 161-1454 | |
| תמיסת ריצה ל-PAGE מסוג Tris/glycine/SDS | Bio-Rad | 161-0732 | |
| סמני משקל מולקולרי צבועים מראש מסדרת Kaleidascope | Bio-Rad | 161-0324 | |
| עמודת Superose 12 30/10 | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| מרכז צנטריפוגלי Amicon | EMD Millipore | UFC801024 | |
| מסנן מזרק | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| בקבועי פרנבך (Fernbach flasks) | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| מנער להחזקת בקבוקי Fernbach | Fisher Scientific | ||
| מערכת Akta | GE Healthcare | ||
| צנטריפוגה גדולה מדגם J6 עם רוטור JLA-8.1000 | Beckman Coulter Inc. | ||
| בקבוקי צנטריפוגה של 1 ליטר | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| צנטריפוגה RC-5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| רוטור בזווית קבועה SS34 ומבחנות | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| אולטראצנטריפוגה דגם רצפה של Sorvall | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| רוטור T647.5 ומבחנות עם פקקים | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| תא לחץ צרפתי (French Pressure Cell) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
מקורות
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
