$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנה של ריאגנטים
- הכן את הכנת המאגר לנתיחה על ידי הוספת מרכיבים הבאים: 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 מ"מ MgCl 2, 2mm KCl, HEPES 5mm, סוכרוז ו 36 מ"מ 1000 PH, 7.2 מ"ל ל ולסנן לעקר.
2. הכנה Dissection
- קוביית Siligard: ג'ל הוא לחתוך סנטימטר בערך רחב, 1 אינץ ארוך על 1cm גבוהה. הקוביה הג'ל מושם על זכוכית שקופית במהלך לנתיחה. קוביות ניתן להשתמש יותר מפעם אחת.
- סיכות: סיכות המשמש לנתיחה צריך להיות תוספת קצרה. החלק התחתון של סיכות חדות minutien עובד הכי טוב לנתיחה.
- זקוק חד באביב מספריים microdissection.
- צריך שני מלקחיים היטה בסדר.
3. אוסף של הזחלים
- הנודד 3 rd הזחלים instar כי מביעים GFP חלבון מתויג שלפוחית נאספים על גבי צלחת פטרי.
- הזחלים נשטפים במים deionized להיפטר כל האוכל.
4. דיסקציה חיים של זחלים
- הזחל מועבר קוביית לנתיחה ג'ל על זכוכית שקופית. הזחל הוא שקוע בתוך חיץ לנתיחה.
- Larva היא שואפת את הקדמי ואת האחורי באמצעות שתי סיכות בסדר עם הצד הגבי למעלה.
- בעזרת מספריים microdissection, חתך קטן הוא עשה את קו האמצע לקראת סוף האחורי. מתוך חתך זה לחתוך נעשית דרך הקדמי. באמצעות שתי סיכות, להצמיד את לציפורן לחתוך בשולי לרוחב.
- הוסף ירידה של ביתור חיץ. הסר בזהירות את הבטן, המעיים וגופים שומן עם מלקחיים. רוב הרקמות הללו בדרך כלל לטפטף החוצה במהלך חיתוך הגבי.
- החלף את החיץ עם חיץ לנתח טריים. הזחל לא צריך להיות יבש כל הזמן צריך להיות ביתור חיץ.
- Incubations משתמש MitoTracker סמנים LysoTracker vivo או נעשים בשלב זה, על ידי דילול בסמן vivo במאגר לנתיחה. לאחר דגירה של בטוש vivo לשטוף את הזחל גזור כמה פעמים (5 שוטף ומהיר) באמצעות חיץ לנתח טריים.
- לאחר החלפת לשטוף האחרונה לדחוף את הסיכות לתוך syligard ומיד coverslip. הזחלים עכשיו הוא מוכן לצורך השגחה.
5. הדמיה חיה של הזחלים גזור
- מניחים את coverslip וג'ל לבמה מיקרוסקופ ותמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
- אנו משתמשים העדשה 100x אל שלפוחית תמונה מתויג בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. ביטוי של GFP בגופם של תא גנגליון הגחון מוערך הראשון לפני עצבים סגמנטלי הם צילמו. אם מכתים GFP חזקים הוא ציין את הגופות תא גנגליון הגחון, עצבים הם צילמו אז בשימוש לצורך הערכה.
- באמצעות מערכת תצוגה כפולה עם מסננים עבור CFP / או YFP RFP / YFP ולהציג תוכנה לפצל אנחנו יכולים בו זמנית two תמונה חלבון מתויג in vivo.
6. נציג תוצאות
איור 1:. תמונה מייצגת מראה שלפוחית axonal רבים על מסלולים רבים בתוך axonal עצב סגמנטלי הזחל הערה כתמים של ה-GFP, המייצג הצטברויות axonal.
איור 2: תמונת מראה נציג מסלול axonal יחיד עם שלפוחית axonal רבים בתוך עצב סגמנטלי הזחל.