טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה לשעבר vivo מצב בתקופות מוגבל המתאים בשלבים midgestation. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים תקן של התרבות שלנו עובר שלם חולדה לאחר E12.5 באמצעות המפרק מסוג התרבות מערכת בקבוק.
מאמר שיטה
טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה לשעבר vivo מצב בתקופות מוגבל המתאים בשלבים midgestation. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים תקן של התרבות שלנו עובר שלם חולדה לאחר E12.5 באמצעות המפרק מסוג התרבות מערכת בקבוק.
העובר שלמים תרבות (WEC) הטכניקה פותחה בשנת 1950 על ידי בניו של וחבריו, והגיש בקשה בביולוגיה התפתחותית 1. למרות התפתחות וצמיחה של עוברי יונקים תלויים באופן קריטי על תפקוד השליה, WEC הטכניקה מאפשרת לנו עכבר התרבות עוברי חולדה מצב vivo לשעבר בתקופות מוגבל המתאים בשלבים עובריים midgestation במהלך היום (ה ') 6.5-E12.5 ב עכבר או E8.5-E14.5 בחולדה 2, 3, 4. ב WEC, אנחנו יכולים ישירות ליעד המבוקש תחומי עוברים באמצעות קנס זכוכית הנימים כי עוברי ניתן להשפיע מתחת למיקרוסקופ. לכן, WEC מכרסם הוא טכניקה שימושית מאוד כאשר אנו רוצים ללמוד תהליכים התפתחותיים הדינמי של עוברי יונקים postimplanted. עד כה, מספר סוגים של מערכות WEC פותחו 1. בין אלה, את הכתף מסוג התרבות מערכת בקבוק הוא הפופולרי ביותר מתאים לתרבות לטווח ארוך של עוברים ב midgestation, כלומר, לאחר E9.5 ואת E11.5 של העכבר חולדה, בהתאמה 1. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים הרגילה שלנו של WEC עכברוש לאחר E12.5 באמצעות מודל מזוקק של מערכת המפרק המקורי, אשר תוכנן על ידי ניו Cockroft 5, 6, ו להציג יישומים שונים של טכניקת WEC ללימודי התפתחותי יונקים הביולוגיה.
1. הגדרת מערכת WEC
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ישנם שני שלבים קריטיים WEC מכרסם להצלחה. ראשית, הליך לנתיחה צריך להיות מדויק ולא עוברים נזק, בעיקר כלי הדם. שנית, ההליך צריך להיות מהר ככל האפשר כי החמצן מזין אינם מסופקים דרך השליה לאחר במנותק מן הרחם. זה קריטי עוברים יותר. במקרה של WEC עכברוש לאחר E12.5, אנחנו צריכים להעביר את העוברים גזור לתוך בקבוקים תרבות בתוך 30 דקות.
ניתחנו דפוסי הנדידה של תאים עצביים לפסגה בסוג בר Pax6 עוברי עכברים מוטנטים על ידי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אנו מודים למר האג'ימה Ichijo עצות עבור וידאו הקלטה מועיל עבור עריכת וידאו. כמו כן, אנו מודים Drs.Yuji Tsunekawa ו Kaichi Yoshizaki עבור עוזר סוג הקלטה וידאו. עבודה זו נתמכת על ידי KAKENHI על B המדען הצעיר על תחומי המדע, מולקולרית המוח עדיפות מ MEXT של יפן. אנו מכירים את התמיכה של גלובל COE תוכנית "יסוד Translational המרכז לחקר מדעי המוח גלובל" מ MEXT של יפן המחקר Core למדע וטכנולוגיה Evolutional ו (CREST) מתוך מדעי החברה היפנית למדע וטכנולוגיה של היפנים הסוכנות וטכנולוגיה (JST) .
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות | |
|---|---|---|---|---|
| שם | סוג | חברה | מספר קטלוגי | הערה |
| הגדרת WEC | ||||
| WEC המערכת (10-0310) | כלי | Ikemoto ריקה | 010-0310 | עוד דגם קטן הוא גם זמין. |
| הסיליקון תקע ללא חור | כלי | Ikemoto ריקה | 010-032-08 | |
| תערובת גז גליל | כלי | ניקו Sanso | - | מכיל 95% חמצן, פחמן דו חמצני & 5%. סדר מותאם אישית. |
| גז הרגולטור | כלי | אונו Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 מיקרומטר לסנן Millex GS | כלי | Millipore | SLGS033SS | |
| הרדמה ובידוד של הרחם | ||||
| מספריים גדול | כלי | Napox | B-7H | |
| מצבטים | כלי | Napox | A-3-2 | |
| צלחת פטרי סילוק (90 מ"מ x 15 מ"מ) | כלי | Iwaki | SH90-15 | עמוק סוג מאכל הוא הטוב ביותר לניתוח. |
| Isoflurane | מגיב | אבוט | B506 | עבור הרדמה |
| Pentobarbital נתרן | מגיב | שרינג פלאו לבריאות בעלי חיים | - | עבור הרדמה |
| של מלח Tyrode | מגיב | - | - | לדברי כפרוטוקול ב Ref. 2. שמור על 4 ° C. |
| מתוזמן בהריון Sprague-Dawley עכברוש | בעל חיים | צ'ארלס ריברס מעבדות יפן | - | |
| הכנת בינוני תרבות | ||||
| בקבוק זכוכית תרבות | כלי | Ikemoto ריקה | 010-032-05 | |
| תרבות סילוק בקבוק | כלי | Ikemoto ריקה | 010-032-06 | |
| הסיליקון תקע עם חור | כלי | Ikemoto ריקה | 010-032-07 | |
| רדיד אלומיניום | כלי | כל חברה | - | |
| מעוקר שקית | כלי | Hogy | HM-26 | עבור בקבוקי תרבות |
| מעוקר שקית | כלי | Hogy | HM-14 א | עבור אטמי סיליקון |
| 0.45 מיקרומטר לסנן Millex HA | כלי | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי | כלי | בקטון דיקינסון | 352070 | |
| 100 מ"ל כוס | כלי | Iwaki | TE-32 | |
| עכברוש IC בסרום | מגיב | צ'ארלס ריברס מעבדות יפן | - | עיין: מר Kunihiko Morisaki, טל: +81- (0) 45-474-9336, פקס: +81- (0) 45-474-9340 |
| D (+), גלוקוז | מגיב | Wako | 041-00595 | |
| לאנטיביוטיקה antimyotic נוזלי | מגיב | Gibco | 15240 | |
| Dissection של עוברים | ||||
| עיניים מספריים ישר | כלי | Napox | MB50-7 | עבור חיתוך דופן הרחם |
| עיניים מספריים מעוקל | כלי | Napox | MB54-2 | עבור חיתוך שק החלמון |
| מלקחיים # 5 | כלי | מרץ | T6715 | |
| מלקחיים # 5F | כלי | רגינה | T6819 | |
| זכוכית פיפטה | כלי | - | - | בעבודת יד באמצעות פיפטה פסטר. |
| מעוקר שקית | כלי | Hogy | HM-4 | עבור pipettes זכוכית |
| המשקפת מיקרוסקופ | כלי | לייקה | Mz7s | |
| אור | כלי | לייקה | CLS 150XD | |
| שמן האבן | כלי | אושידה יוקו | 833-2000 | עבור השחזה של מלקחיים |
| מכונת שמן | כלי | אושידה יוקו | 835-0000 | עבור השחזה של מלקחיים |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה