Method Article

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח

DOI:

10.3791/2220

⸱

December 21st, 2010

 ,  , 
1Department of Biology, Portland State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שכפול מדויק בנוכחות נזק לדנ"א אחראי על רוב rearrangements הסלולר mutagenesis נצפתה בכל סוגי התאים הוא האמין נרחב כדי להיות מקושר ישירות עם התפתחות של סרטן בבני אדם. נזק לדנ"א, כגון זה הנגרם על ידי קרינת UV, קשות ביכולתם של שכפול לשכפל את הגנום תבנית מדויקת. מספר מוצרים הגן זוהו נדרשים כאשר שכפול ה-DNA מפגשים נגעים בתבנית. עם זאת, האתגר שנותר היה לקבוע כיצד החלבונים האלה נגעים במהלך תהליך השכפול

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צמיחה הקרנת UV.

  1. 200μl של תרבות לילה טרי פלסמיד המכיל את pBR322 גדל דייויס בינוני 1 בתוספת גלוקוז 0.4%, 0.2% חומצות casamino, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל תימין (בינוני DGCthy) ו -100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין הוא pelleted. התא הוא גלולה resuspended אז בינוני DGCthy 200μl חסר אמפיצילין ומשומשים לחסן 20 מ"ל של מדיום DGCthy.
  2. תרבויות גדלים ללא בחירה אמפיצילין ב חממה רועד ב 37 ° C עד 600 OD של 0.5 (~ 5 x 10 8 תאים / מ"ל). צמיחה ללא אמפיצילין נמנע מבחר ביניים נגד שכפול....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות אופייניות שהתקבלו תאים סוג בר בנוכחות והיעדר נזק UV-Induced מוצגים באיור 1. בהעדר נזק, ~ 1% מה-DNA של פלסמיד הכולל ניתן למצוא קשת Y כאשר התאים גדל במהירות בשלב מעריכי. בעקבות הקרנה, גידול חולפות מולקולות בצורת Y הוא ציין כמו מזלגות שכפול חסום לצבור באתרים שניזוקו. ה-X בצורת ביניים שכפול גם transiently מצטברים להתמיד עד אשר תואמת כאשר הנגעים הם תוקנו.

במקום ניתוח הדרום ביניים שכפול ניתן אגרוף מתוך הג'ל .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדה שלנו נתמך על ידי אות הקריירה MCB0551798 מן הקרן הלאומית למדע אזור להעניק R15GM86839 מן NIGMS-NIH.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דוגמה לניתוח הדרומי של הג'ל הדו-ממדי שנבדקGE HealthcareG15T8Yellow Lighting
15 μ מנורת קוטל חיידקים וואטסילבניהF20T12/GOמנורת UV
מד עוצמת UV Blak-Ray 254nmDaiggerEF28195Tפוטומטר UVC
0.025 μ m דיסקים נקבובייםWhatman, GE HealthcareVSWP04700דיסקי דיאליזה צפים
PvuIIFermentasER0632הגבלת אנדונוקלאז
ערכת תרגום ניקRoche Group976776להכנת נייר בדיקה עם תווית 32P
Whatman, GE Healthcare3030-704להעברה דרומית
ממברנת ניילוןGE HealthcareRPN203Sעבור העברה דרומית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
  2. Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two dimensional Gel ElectrophoresisDNA Replication IntermediatesUV induced DNA DamagePlasmid PBR322 AnalysisAgarose Gel AnalysisSouthern BlottingRestriction Enzyme DigestionAlkali Transfer SystemReplication Fork ReversalNucleotide Excision Repair

Related Articles