אנו מציגים הליך שבאמצעותו דו מימדי agarose ג'ל ניתוח יכול לשמש כדי לזהות את מבנה ביניים שכפול המתרחשות בעקבות קרינה UV.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
שכפול מדויק בנוכחות נזק לדנ"א אחראי על רוב rearrangements הסלולר mutagenesis נצפתה בכל סוגי התאים הוא האמין נרחב כדי להיות מקושר ישירות עם התפתחות של סרטן בבני אדם. נזק לדנ"א, כגון זה הנגרם על ידי קרינת UV, קשות ביכולתם של שכפול לשכפל את הגנום תבנית מדויקת. מספר מוצרים הגן זוהו נדרשים כאשר שכפול ה-DNA מפגשים נגעים בתבנית. עם זאת, האתגר שנותר היה לקבוע כיצד החלבונים האלה נגעים במהלך תהליך השכפול
פרוטוקול
1. צמיחה הקרנת UV.
- 200μl של תרבות לילה טרי פלסמיד המכיל את pBR322 גדל דייויס בינוני 1 בתוספת גלוקוז 0.4%, 0.2% חומצות casamino, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל תימין (בינוני DGCthy) ו -100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין הוא pelleted. התא הוא גלולה resuspended אז בינוני DGCthy 200μl חסר אמפיצילין ומשומשים לחסן 20 מ"ל של מדיום DGCthy.
- תרבויות גדלים ללא בחירה אמפיצילין ב חממה רועד ב 37 ° C עד 600 OD של 0.5 (~ 5 x 10 8 תאים / מ"ל). צמיחה ללא אמפיצילין נמנע מבחר ביניים נגד שכפול....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תוצאות אופייניות שהתקבלו תאים סוג בר בנוכחות והיעדר נזק UV-Induced מוצגים באיור 1. בהעדר נזק, ~ 1% מה-DNA של פלסמיד הכולל ניתן למצוא קשת Y כאשר התאים גדל במהירות בשלב מעריכי. בעקבות הקרנה, גידול חולפות מולקולות בצורת Y הוא ציין כמו מזלגות שכפול חסום לצבור באתרים שניזוקו. ה-X בצורת ביניים שכפול גם transiently מצטברים להתמיד עד אשר תואמת כאשר הנגעים הם תוקנו.
במקום ניתוח הדרום ביניים שכפול ניתן אגרוף מתוך הג'ל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
העבודה במעבדה שלנו נתמך על ידי אות הקריירה MCB0551798 מן הקרן הלאומית למדע אזור להעניק R15GM86839 מן NIGMS-NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דוגמה לניתוח Southern של ג'ל דו-ממדי שעבר היברידיזציה | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| מנורה קוטלת חיידקים בהספק 15 μwatt | Sylvania | F20T12/GO | מנורת UV |
| מד עוצמת UV מדגם Blak-Ray 254nm | Daigger | EF28195T | פוטומטר UVC |
| דיסקיות נקבוביות בגודל 0.025 μm | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | דיסקיות דיאליזה צפות |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | אנדונוקלאז הגבלה |
| ערכה להעברה בשיטת Nick-translation | Roche Group | 976776 | ליצירת גשוש מסומן ב-32P |
| נייר בלটিং | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | להעברה בשיטת Southern |
| ממברנת ניילון | GE Healthcare | RPN203S | להעברה בשיטת Southern |
מקורות
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regres....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
