אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

סיכום

עמותות גנטית לעתים קרובות להישאר בלתי מוסבר ברמה התפקודית. שיטה זו נועדה להעריך את ההשפעה של פנוטיפ הקשורים סמנים גנטיים על ידי ניתוח ביטוי גנים בתאים הטרוזיגוטיים SNPs עיבד. הטכנולוגיה מאפשרת מדידה מדויקת של MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה לכמת ספציפי אלל פריימר המוצרים הרחבה.

תקציר

מספר עמותות גנטי משמעותי עם תכונות מורכבות נפוצה היא עולה בהתמדה. עם זאת, רוב עמותות אלה אינן מובנות ברמה המולקולרית. אחד המנגנונים המתווך את ההשפעה של גרסאות ה-DNA על פנוטיפים הוא ביטוי גנים, אשר הוכח להיות רלוונטי במיוחד עבור תכונות מורכבות ^1.

שיטה זו בדיקות בהקשר הסלולר את ההשפעה של רצפי DNA ספציפיים על ביטוי גנים. העיקרון הוא למדוד את השפע היחסי של תמלילי הנובעים שני אללים של הגן, ניתוח תאים הנושאים עותק אחד של רצפי DNA הקשורים במחלה (גרסאות סיכון) ^2,3. לכן, תאים המשמשים בשיטה זו צריכים להיפגש genotypic שתי דרישות בסיסיות: הם צריכים להיות הטרוזיגוטיים הן עבור גרסאות הסיכון הדנ"א סמנים DNA, פולימורפיזמים בדרך כלל קידוד, אשר יכול להבחין תמלילי על בסיס מוצא הכרומוזומים שלהם (איור 1). הסיכון DNA וריאנטים וסמנים DNA לא צריך את תדירות האלל אותו אבל את השלב (haplotypic) מערכת היחסים של סמנים גנטיים צריך להיות מובן. חשוב גם לבחור את סוגי תאים המבטאים את הגן של עניין. פרוטוקול זה מתייחס במיוחד כדי ההליך אימצה לחלץ חומצות גרעין מ fibroblasts אבל השיטה היא החלים באופן שווה על סוגי תאים אחרים, כולל תאים ראשוניים.

DNA ו-RNA המחולצים שורות תאים שנבחרו cDNA נוצר. דנ"א cDNA מנותחים עם assay תחל הרחבה, נועד למקד את סמני DNA קידוד ^4. Assay הארכת תחל מתבצעת באמצעות (Sequenom) MassARRAY ⁵ פלטפורמה פי מפרט של היצרן. הארכה מוצרי פריימר מנותחים מכן על ידי לייזר מטריקס בסיוע desorption / שעה יינון של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS). מכיוון סמנים שנבחרו הטרוזיגוטיים הם ייצרו שתי פסגות על פרופילים MS. שטח שיא כל פרופורציונלי שפע התמליל ניתן למדוד עם פונקציה של התוכנה Typer MassARRAY כדי ליצור יחס allelic (אלל 1: אלל 2) החישוב. היחס allelic שהתקבלו cDNA הוא מנורמל באמצעות שמדד מ-DNA גנומי, שם היחס allelic צפוי להיות 1:01 לתקן חפצים טכנית. סמנים עם יחס allelic מנורמל שונה משמעותית 1 לציין כי כמות של תמליל שנוצר משני כרומוזומי באותו תא הוא שונה, דבר המצביע על כך גרסאות ה-DNA הקשורים הפנוטיפ יש השפעה על ביטוי גנים. שולטת ניסויית יש להשתמש כדי לאשר את התוצאות.

פרוטוקול

1) תא התרבות

1. בחירת סוגי תאים המבטאים את הגן של עניין.
2. בחירת שורות תאים הטרוזיגוטיים הן בסיכון גרסאות ה-DNA פולימורפיזם קידוד עיבד בתוך הגן של עניין (איור 1).
3. תרבות שורות תאים נבחרים על פי מפרט של הספק ולהכין 2 x 10 ס"מ בצלחות פטרי להפקת DNA ו-RNA, בהתאמה.
4. כאשר התאים מגיעים 80% מפגש להתחיל את ההליך תאים יבולים ולבודד DNA ו-RNA או ביצוע ההליך המתואר להלן או באמצעות ערכות זמינים מסחרית.

2) מיצוי DNA

1. הסר מדיה המנה, לשטוף עם PBS ולהוסיף μL את צלחת 500 של פתרון תמוגה (0.6% SDS, 100 mM NaCl, 50 מ"מ טריס, 20 mM EDTA ו - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase A).
2. הסלע צלחת בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לגרד את lysate התא לתוך צינור microcentrifuge ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. הוסף proteinase K לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
5. חלץ את ה-DNA עם נפח שווה של פנול, כלורופורם pH 8, חזור, ואז לחלץ עם נפח שווה של אלכוהול כלורופורם / isoamyl.
6. להאיץ את ה-DNA עם 1 / 10 נפח ^ה 3 M NaCl ו - 2.5 כרכים של 100% אתנול.
7. השאירו על קרח דק 5 ואז לסובב בסל"ד 13,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C.
8. לשטוף את ה-DNA עם אתנול 70%, כדי לאפשר אוויר יבש resuspend ב μL של TE 200.
9. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן יוצאים 2 ימים בטמפרטורת החדר.
10. חנות ב 4 מעלות צלזיוס או לטווח ארוך ב -20 ° C.

3) הפקת רנ"א

1. הסר מדיה המנה, לשטוף עם PBS, מוסיפים 1 מ"ל של TRIzol ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. תאים לגרד, פיפטה כמה פעמים, להעביר בצינור microcentrifuge ו דגירה של 5 דקות.
3. ספין דקות 10 בסל"ד 10,000 ב 4 ° C.
4. מעבירים את supernatant בצינור טריים להוסיף 200 μL של כלורופורם.
5. להתגעש ו ספין דקות 10 בסל"ד 10,000 ב 4 ° C.
6. מעבירים את השלב מימית בתוך שפופרת טריים להוסיף נפח זהה של אתנול 70%.
7. טען הפתרון 1 או 2 (בהתאם לכמות) טור ספין RNeasy ובמשך 30 שניות במהירות המרבית.
8. מכאן בעקבות הוראה של הערכה RNeasy (Qiagen).

4) חומצות גרעין לדוגמא הכנה

1. לכמת DNA ו-RNA ריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (Thermo Scientific).
2. הכנת cDNA מ ng 500-1000 של רנ"א באמצעות decamers אקראי עילי III הפוך transcriptase (Invitrogen) על פי הוראות היצרן.

5) ו-PCR הרחבה Assay פריימר

1. עיצוב שני זוגות של primers PCR עבור כל סמן ה-DNA, זוג אחד עבור הגברה DNA גנומי לבין זוג אחרים הגברה cDNA (איור 2). מקום קדימה לאחור תחל עבור cDNA הגברה ב אקסונים שונים, כדי למנוע זיהום גנטי. עיצוב תחל לקבל מוצר PCR בטווח של 100-500 אורך נ"ב.
2. הכן 10 μL תגובת PCR כולל 0.5 U Immolase תקי (Bioline) dNTPs 0.8 מ"מ, 2 מ"מ MgCl _2, 0.2 מ 'כל אחד ו - 20 ng פריימר או של cDNA או דנ"א. Amplify כל מדגם בארבעה תגובות עצמאיות.
3. הפעל את תגובת ה-PCR בתנאים אופטימיזציה עבור כל זוג פריימר שמירה מספר מחזור בשלב ליניארי של הגברה.
4. הסר פריימר PCR ו dNTPs עודף ידי דוגרים המוצר PCR עם exonuclease ואני phosphatase שרימפס אלקליין (SAP) בשעה 37 ° C במשך 20 דקות.
5. ספוט כל מוצר PCR פעמיים על צלחת 384, טוב, כך 8 מדידות יהיה זמין עבור כל דגימה.
6. עיצוב תחל הרחבה עם תוכנת עיצוב (Sequenom) Assay כך פריימר אותו יכול לשמש עבור מוצרים PCR הן cDNA גנומי. ציין אורך תחל בטווח של 14-18 נ"ב ומערבבים הרחבה כולל שילובים של 3ddNTPs (איור 2).
7. ביצוע ההארכה פריימר התגובה וניתוח MALDI-TOF/MS באמצעות מערכת MassARRAY (Sequenom) בהתאם להוראות היצרן.
8. תגובה אופיינית הארכת תחל כוללים צעד החל מ 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 5 s.
9. הארכה המוצרים תחל מנקים עם שרף SpectroCLEAN והועברו על microarray (שבב) על ידי מנפק nanolitre SpectroPOINT.
10. Oligonucleotides המורחבת הם לכמת ידי MALDI-TOF באמצעות ספקטרומטר מסה SpectroREADER.

6) ניתוח סטטיסטי

1. בדוק תוצאות MALDI-TOF/MS עם התוכנה Typer MassARRAY לאיכות הכללית של הניסוי.
2. תמצית הדו"ח Allelotyping הכולל את הנתונים אזור השיא.
3. עבור כל קשת הפרט לחשב אתהיחס בין שטח השיא של אלל אלל 1 ו 2 (יחס אזור השיא).
4. עבור כל דגימה cDNA לגזור אזור השיא יחס ממוצע וסטיית התקן, באמצעות הפונקציה המתאימה ב-Excel, על פני 8 מדידות.
5. לגזור את אותו אזור מתכוון יחס שיא ברחבי 8 measurments עבור ה-DNA הגנומי.
6. מחלקים את יחס ממוצע cDNA על ידי היחס אומר גנטי כדי להעריך את הסטייה ליחס 01:01 צפוי.

7) ניסיוני Controls

1. כדי לשלול ממצאים ניסויים, לחזור על הניסוי לפחות שלוש פעמים.
2. במידת האפשר, עיצוב מבחני עבור סמני דנ"א נוספים.
3. עיצוב מספר זוגות PCR פריימר ואת primers הרחבה חישול אל חוטי שתי קדימה לאחור.
4. בכל פעם מבחן האפשרי קווי שולטת שלילי סלולריים, כי הם הטרוזיגוטיים סמני ה-DNA, אך לא לשאת את הסיכון DNA וריאנטים הקשורים הפנוטיפ (איור 1, איור 3.)

8) נציג תוצאות

דוגמה של ניתוח אלל מסוים הביטוי שמוצג באיור 3 עם דוגמאות של עקבות ספקטרומטריית מסה. האיור מציג את תוצאות ניתוח של 4-אלל מסוים תחל מוצרים הרחבה שבוצעו על 4 תבניות שונות. גרפים העליון מייצג את התוצאות שהתקבלו מניתוח של הדנ"א הגנומי של שתי שורות תאים שונות, אשר שניהם הטרוזיגוטיים פולימורפיזם קידוד עיבד. עם זאת, רק קו תא הוא הטרוזיגוטיים עבור גרסה הסיכון DNA (איור 1). גרפים התחתון מייצג את התוצאות שהתקבלו מניתוח של cDNA שנוצר משימוש שורות תאים זהים. כתוצאה חפץ ניסיוני השיא הראשון הוא תמיד גבוה יותר מאשר השיא השני אפילו בניתוח הגנומי. לכן, התוצאות מניתוח גנומית משמשים לנרמל את הנתונים cDNA. לאחר נורמליזציה, יחס אלל שונה מהותית 1 בתור תא (כאשר השיא השני מופיע נמוך יותר לעומת הספקטרום אחרים), כאשר הוא קרוב מאוד 1 בתור תא B. הנתונים מראים כי קו התא נושא גרסה ה-DNA, בשלב עם אלל נמדד השיא השני, אשר מפחית את הביטוי של הגן תחת ניתוח. קו B Cell מספק שליטה נוחה מאוד שלילי.

באיור 1. קו סלולרי אסטרטגיה הבחירה. שורות תאים A ו-B הם הטרוזיגוטיים סמן קידוד עיבד (משולש) אלא רק שורת תאים הוא הטרוזיגוטיים עבור גרסה הסיכון DNA (עיגול). האלל הכחול של וריאנט את הסיכון קשורה (או עם השפעה ישירה או משום מתאם הדוק עם גרסה התפקודית בפועל) עם רמה נמוכה של שעתוק.

איור 2. אלל ספציפי תחל הרחבה assay. נתון זה מראה את העבודה זרימה של הליך הניסוי שנערך עבור ה-DNA הן (מימין) תבניות cDNA (משמאל) הגנומי. PCR primers (מלבנים אפורים) נועדו להגביר פולימורפיזם קידוד הטרוזיגוטיים (משולש). כדי למנוע זיהום גנטי PCR primers לחשל רצפים להציב אקסונים שונים (אור ברים כחול) כאשר ההגברה נעשית על תבנית cDNA. המוצר PCR משמש אז לתגובת תחל הרחבה ביצע עם פריימר שלוחה כתבנית, חישול בסיס אחת ליד פולימורפיזם, ואת תערובת מתאימה של dideoxynucleotide שלושה (ddNTPs) לחסרי (ריבועים) ואחד deoxynucleotide (עיגול) להאריך את פריימר של בסיס אחד או שניים בהתאמה. הארכה המוצרים וכתוצאה מכך יש פריימר ההמונים שונים המאפשרים הפרדה וכימות ידי ספקטרומטריית MALDI-TOF המוני. כמות המוצר המתאים האלל הכחול של סמן ה-DNA הוא יחסית נמוך אלל אדום.

איור 3. תוצאות assay-אלל מסוים הביטוי. הדמות להציג את התוצאות ספקטרומטריית מסה מניתוח שנערך על ה-DNA הגנומי ואת cDNA של שורת תאים קו תא B (איור 1).

דיון

שיטה זו מאפשרת הערכה של ההשפעה של מחלות הקשורות גרסאות ה-DNA על ביטוי גנים על ידי השומה ההבדל vivo אלל ספציפי ברמת התמליל. בפרוטוקול זה שפע תמליל יחסי נמדדת MALDI-TOF אבל טכנולוגיות אחרות המאפשר כימות אלל ספציפי, כגון TaqMan ^6,7, ניתן להשתמש. המגבלה העיקרית של גישה זו היא הזמינות של סמנים קידוד עיבד. שיטות מבוססת על העיקרון המתואר כאן, אלא ניצול של סוגים שונים של פולימורפיזם, תוארו. Assay haploChip אמצעים אלל ספציפי ביטוי באמצעות סמנים ממוקם בתוך 1 קילו של תחילת תעתיק או אתר בסופו של הגן אשר יהיה נוכח חומר הכרומטין immunoprecipitated מבודד עם נוגדנים ספציפיים RNA פולימראז II ^8. לחלופין, intronic SNPs ניתן להשתמש כאשר התבנית הוא heteronuclear RNA ^9.

פרוטוקול מסוים המתואר כאן, בשילוב עם assay haploChip, שימש בהצלחה לזהות גן מועמד דיסלקציה (או לקות קריאה). בתחילה מחקר גנטי העמותה זיהו רצף דנ"א הקשורים דיסלקציה אשר פורש שלושה גנים ^10. אלל ספציפי assay ביטוי גנים הראו כי בנוכחות של דיסלקציה הקשורים וריאציה גרסאות ה-DNA ביטוי נצפתה רק אחד משלושת הגנים, אך לא את שני ^11.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PBS	Sigma-Aldrich	P-4417-100TAB
SDS	Bio-Rad	161-0416
NaCl	VWR international	27788.366
טריס (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
RNase A	Qiagen	19101
פרוטאינז K	Sigma-Aldrich	P2308-500MG
פנול: כלורופורם	Sigma-Aldrich	77617
כלורופורם	VWR international	100777C
אתנול	Sigma-Aldrich	32221-2.5L
Trizol	Invitrogen	15596-018
ערכה RNeasy	Qiagen	74104
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-044
Immolase Taq	Bioline	BIO-21048
dNTP	Sigma-Aldrich	DNTP100A
אקסונוקליאז 1	New England Biolabs	M0293S
אלקליין פוספטאז מחריג (Shrimp Alkaline Phosphatase)	GE Healthcare	E70092Z
שרף SpectroCLEAN	Sequenom	10053
תערובת ddNTP/dNTP של MassEXTEND	Sequenom		משתנה בהתאם לתכנון הבדיקה
MassEXTEND thermosequenase	Sequenom	10052
<חזק>ציוד
מיקרוצנטריפוגה מקוררת	Eppendorf
ספקטרופוטומטר NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Inc.
מפיק ננו-ליטר SpectroPOINT	Sequenom
ספקטרומטר מסות SpectroREADER	Sequenom