הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים (למשל, Pristionchus פקיפיקוס) במעבדה ולהראות שתי שיטות mutagenesis שונים, EMS ו-tmp / UV.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לשמור על נמטודות במעבדה וכיצד mutagenize אותם באמצעות שתי שיטות חלופיות: sulfonate מתאן אתיל (EMS) ו - 4, 5 ', 8-trimethylpsoralen בשילוב עם אור אולטרה סגול (TMP / UV). נמטודות הן מערכות ביולוגיות עוצמה עבור מחקרים בגנטיקה בגלל תוכנית פשוטה הגוף שלהם ואת מערכת הרבייה, המורכבת עצמית זבול הרמפרודיטים וזכרים כי ניתן להפיק מאות צאצאים לכל בעלי החיים. נמטודות נשמרות צלחות אגר המכיל דשא של חיידקים ניתן להעביר בקלות מהצלחת אחד למשנהו באמצעות להרים. EMS הוא סוכן אלקילציה נפוץ לגרום מוטציות נקודתיות ומחיקות קטן, בעוד tmp / UV גורמת בעיקר מחיקות. בהתאם מינים של נמטודות בשימוש, ריכוזים של EMS ו TMP יהיה חייב להיות מותאם. כדי לבודד מוטציות רצסיביות של פקיפיקוס נמטודות Pristionchus, בעלי חיים של דור F2 הוקרנו חזותית עבור פנוטיפים. כדי להמחיש את השיטות הללו, אנו mutagenized תולעים וחיפשתי מתואמים (UNC), גוצה (Dpy) ו שנאי (טרה) מוטנטים.
פרוטוקול
חלק 1: הכנת צמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות פטרי
נמטודות ניסויית כגון C. elegans ו פ פקיפיקוס הם בדרך כלל בתרבית במעבדה על 6 צלחות פטרי ס"מ המכיל צמיחה נמטודות בינוני (NGM) 1. תולעים נשמרים 20 ° C, אבל יכול להיות מודגרות בטווח של טמפרטורות (בין 4 ° C - 25 ° C), בהתאם למין נמטודות ותכנון ניסויים. כדי להכין צלחות עם NGM, טכניקות סטרילי תקן צריך לשמש כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי. להלן פרוטוקול להכין צלחות NGM:
- לשקול 15 אגר גרם, 2.4 גרם NaCl, 2 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Mutagenesis היא טכניקה מועסקים נרחב עבור מחקרים גנטיים שונים של אורגניזמים מודל ניסיוני. ניסויים mutagenesis משמשים לעתים קרובות כדי לזהות את הפונקציה של הגן 2. הנהלים mutagenesis המתואר כאן ניתן להשתמש לא רק על פ פקיפיקוס, אלא גם עבור ג אלגנס ושאר מיני נמטודות בנושא. כאן אנו מתארים את שתי השיטות, EMS ו-tmp / UV mutagenesis.
EMS הוא חומר כימי שגורם מוטציות נקודה או מחיקות קטנות לאורך .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו כבר ממומן על ידי NSF מענק IOB # 0615996.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מקורות
- Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).
- Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).
- Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).
- Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).
- Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).
- Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Gene....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
