מאמר שיטה

דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים

24.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2325

⸱

18 בינואר 2011

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

זוהי הפגנה של כמה ממברנות ביולוגיות ניתן להבין באמצעות מודלים חשמל. אנחנו גם מדגימים נהלים הקלטה פוטנציאל פעולה מחוט עצב הגחון של סרטנים עבור מעבדות סטודנט חוקיים.

תקציר

זוהי הפגנה של כמה מודלים חשמלי יכול לשמש כדי לאפיין קרומים ביולוגיים. תרגיל זה גם מציג המינוח biophysical בשימוש electrophysiology. הציוד אותו הוא משמש מודל הממברנה כמו לחיות על ההכנות. כמה מאפיינים של חוט העצב מבודד נחקרות: פוטנציאל הפעולה העצבי, גיוס של נוירונים, ואת ההיענות של חוט העצב לגורמים סביבתיים.

פרוטוקול

1. מבוא

1.1) רקע

ידע בסיסי במעגלים חשמליים הוא כלי בעל ערך להבנה ולתפיסה של היבטים רבים בניסויים ובתיאוריות פיזיולוגיות. תרגיל זה נועד להכירכם עם כמה עקרונות כלליים הנוגעים למקורות מתח, התנגדות חשמלית וקיבול חשמלי. מושגי מבוא אלה מספקים את הרקע להבנת תופעות כגון העברה סינפטית והתפשטות של אותות חשמליים לאורך סיב עצב.

מילת אזהרה: במעגלים חשמליים סטנדרטיים יומיומיים המורכבים מחוטי מתכת ונגדים, הזרם מובל על ידי אלקטרונים, בעלי מטען שלילי. במערכות ביולוגיות, הזרם מובל על ידי יונים, שעשויים להיות בעלי מטען חיובי או שלילי אחד או יותר. לפי המוסכמה, הזרם זורם מחיובי לשלילי (אם כי כמובן שהאלקטרונים נעים בפועל בכיוון ההפוך).

רכיבי המעגל מייצגים את התכונות החשמליות של רקמה חיה ובמקרים מסוימים את אלו של עצמים דוממים (כגון אלקטרודות) המעורבים במחקרה.

במהלך ביצוע התרגיל, רשמו הערות על התוצאות והחישובים.

1.2) עקרונות כלליים

התכונות הבסיסיות של מעגלים חשמליים שבהם זורם זרם ישר מתוארות על ידי חוק אוהם
V = IR
כאשר V = מתח בוולטים (V)
I = זרם באמפרים (A)
R = התנגדות באוהמים (Ω)

חוק זה שולט בפוטנציאלים הנצפים בתאי עצב באמצעות אלקטרודות. ראשית, נדגים את חוק אוהם ואת יישומו בחומרים ביולוגיים.

1.3) חומרים

פריטכמות
לוח לחם (Breadboard)1
נגדים: 330 K Ω1
: 100 K Ω12
: 33 K Ω6
: 22 K Ω1
: 10 K Ω6
: 4.7 K Ω1
: 2.2 K Ω1
: 1.5 K Ω1
: 1 K Ω1
: 510 Ω1
: 330 Ω1
: 220 Ω1
: 150 Ω1
: 100 Ω1
קבלים: 0.1 μF6
: 10 μF6
חוטים12
PowerLab1
כבלי פלט של PowerLab1
כבלי קלט של PowerLab1
וולטמטר (בעל יכולת מדידת זרם)1

מפתח קידוד נגדים

צבעספרה
שחור0
חום1
אדום2
כתום3
צהוב4
ירוק5
כחול6
סגול7
אפור8
לבן9
כסוף10% Tolerance
זהב5% Tolerance

1נא לספק את טקסט המקור באנגלית לתרגום. פס - 1נא לספק את הטקסט למסמך שברצונך לתרגם. ספרה
2נד פס - 2נד ספרה
3rd פס - מספר האפסים
4th פס - טולרנס

הסדרה של ניסוי אלקטרוניקה עם מחשב, רב-מודד, ולוח בדיקות (breadboard) לניתוח ובדיקת מעגלים.
איור 1: הגדרת המערכת. מחשב, לוח בדיקות ומעבדה להספק עם ממריץ פלט.

מערכת ה-PowerLab (ממשק PowerLab מבית AD Instruments, אוסטרליה) תשמש כמקור המתח בניסוי זה. חברו את כבל ה-USB של ה-PowerLab למחשב, הפעילו את ה-PowerLab ופתחו את תוכנת LabChart משולחן העבודה. בחרו ב-"New File". יופיע חלון עם מספר ערוצי הקלטה. בחרו ב-"Setup" בחלק העליון ולחצו על "Channel Settings". בפינה השמאלית התחתונה של החלון, הפחיתו את מספר הערוצים (Number of Channels) ל-1; בערוץ 1, שנו את הטווח (Range) ל-5 V. חברו את כבל הגירוי (Stimulator) עם שני מוליכי ה-mini-hook לפורטי הפלט (Output portals) ב-PowerLab: חברו את כבל החיבור האדום לפורט הפלט החיובי ואת כבל החיבור השחור לפורט הפלט השלילי. בשלב הבא, יש לשנות את פלט ההספק, התדירות ומשך הפולס של ה-PowerLab. כדי לעשות זאת, בחרו ב-"Setup" ולאחר מכן ב-"Stimulator Panel". עבור החלק הראשון של הניסוי נדרשים פולסים ארוכים של 1.5 V, לכן כווננו את האמפליטודה ל-0.75 V; פעולה זו תיתן טווח של 1.5 V (ה-PowerLab יפלוט מתח התנודד בין 0.75 V חיובי לשלילי). הגדירו את התדירות (0.5 Hz) ואת משך הפולס (1 s).

תרשים אלקטרופורזה; תהליך הפרדת DNA; נתיבי הג'ל מראים הבדלים במשקל מולקולרי
איור 2: סכימות של לוח לחם (Breadboard). פסי הצבע לאורך הצדדים מחוברים כולם כיחידה אחת עבור צבע נתון. 2 העמודות האופקיות במרכז מחוברות בכל חצי, עבור שורה נתונה, אך אינן חוצות את קו האמצע או את פסי הצד. כל שורה במרכז היא בלתי תלויה בשורה הבאה אחריה.

בעת שימוש בלוח לחמים (breadboard), קיימות שתי עמודות משני הצדדים המשמשות להולכי כניסה ומוצא. הקוטב החיובי מחובר בדרך כלל לעמודת החיובי הימנית, שבה כל החריצים בעמודה מחוברים ביניהם. כניסת הקוטב השלילי מחוברת לצד הנגדי של לוח הלחמים, שבו שוב, כל החריצים בעמודה מחוברים. במרכז, בין שתי קבוצות העמודות, נמצאות שורות מרובות של חמישה תאים, שכל אחת מהן בלתי תלויה באחרות. כל התאים בשורה של חמישה מחוברים ביניהם אך מבודדים משורות אחרות. ראו איור 2. האזורים המודגשים מראים אילו חלקים בלוח הלחמים מחוברים זה לזה. סרטון שימושי על שימוש בלוח לחמים ניתן למצוא באינטרנט בכתובת http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related

תרגיל 1

השתמש בחוקו של אוהם כדי לחשב את הזרם הזורם במעגל הבא:
תרשים מעגל חשמלי, שיווי משקל סטטי, סוללה של 1.5V, נגד של 1500Ω, ניתוח זרם.
זרם (רשת 1): ________________A

תרגיל 2
מדדו את המתח על פני הנגד, את התנגדות הנגד ואת הזרם הזורם במעגל שלעיל (רשת 1).

מולטימטר דיגיטלי המציג ערך קיבול; חיוני למדידות ואבחון חשמליים.
איור 3: וולטמטר Wavetek Meterman.

שחזרו את רשת 1 על לוח הבדיקות (breadboard) באמצעות נגד של 1500 Ω; מכשיר ה-PowerLab משמש כמקור המתח (1.5 V). מדידות של מתח, זרם והתנגדות מבוצעות באמצעות מד הוולט (Volt meter). כדי שמד הוולט יאסוף נתונים מדויקים, הן הפרוב האדום והן הפרוב השחור חייבים להיות במגע עם חוט חשוף במעגל. כמו כן, יש לכוון את החוגה למתח DC בטווח המתאים לקנה המידה של כל מערך ניסויי בודד. למדידת המתח, הגבישו את שני הפרובים של מד הוולט על שני קצותיו של הנגד. בעת מדידת ההתנגדות של הנגד (ולא מפל המתח), נתקו את מקור המתח, ושוב, הגבישו את שני הפרובים על הנגד. כדי למדוד זרם, מד הוולט חייב להיות מחובר בטור במעגל; שימו לב כי הפרובים האדום והשחור חייבים להיות מכוונים כראוי ביחס לזרימת הזרם.

מתח (רשת 1): ________________V
התנגדות (רשת 1): ________________Ω
זרם (רשת 1): ________________A

כעת, באמצעות ה-Power Lab, מדדו את המתח על פני רשת 2 (זהה לרשת 1, אך על לוחבדיקה), בדיוק כפי שעשיתם עם הוולטמטר. נתקו את הוולטמטר וחברו את המוליכים של גשש מדידת המתח באמצעות התפסים האדום והשחור. לאחר מכן, השתמשו בסמן כדי ללחוץ על "Channel 1" (בצד ימין של המסך). לחצו ועברו ל-"input amplifier". לאחר מכן, בתיבה, לחצו על כפתור ה-"differential" והגדירו את הטווח ל-5 V. לחצו על "OK" כדי לשמור את השינויים.

לחצו על "Start" (בפינה הימנית התחתונה) כדי לאסוף נתונים. ניתן לעצור בכל עת כדי למדוד את סטיות המתח. כדי למדוד את המתח שנאסף, לחצו על "Stop", השתמשו בסמן "M" (בפינה השמאלית התחתונה) והזיזו אותו אל קו הבסיס על ידי גרירה. לאחר מכן, השתמשו בסמן החופשי בראש עקומת המתח כדי למדוד את האמפליטודה. קראו את השינוי במתח (ΔV) ורשמו את הנתונים על דף. ניתן לאשש את התוצאות באמצעות מד מתח (voltmeter) עצמאי.

1.4) התנגדות ומוליכות בטור

עקרון מחלק המתח: מפל המתח על סך כל ההתנגדויות המחוברות בטור שווה למתח המקור. המתח על כל נגד בודד תלוי בחלק מההתנגדות הכוללת אותו נגד מייצג. לפיכך:
משוואת מחלק מתח; V1=V(source)R1/(R1+R2); נוסחה לניתוח מעגלים; תכנון אלקטרוני.
זוג נגדים יחלקו את המתח ביחס להתנגדויותיהם האישיות.

תרגיל 3

חשבו את מפלט המתח על פני כל נגד ברשת 3. בדקו את החישובים שלכם על ידי מדידת המתח בפועל באמצעות הוולטמטר ותוכנת ה-power lab, כאשר מקור מתח של 1.5 V מחובר.
תרשים מעגל חשמלי, מקור 1.5V, נגדים R1 510Ω, R2 1500Ω, ניתוח שיווי משקל סטטי.
רשת 3. השתמשו בשני הנגדים המצוינים לעיל.

חושב:נמדד:
מתח (על פני R)1):_______Vמתח (על פני R)1): ________________V
מתח (על פני R)2):_______Vמתח (על פני R)2): ________________V

1.5) יישום ביולוגי לדגימה:

התכונות החשמליות השונות של פנים התא והתמיסה החיצונית של תא עצב פעיל מהוות דוגמה למחלק מתח. ניתן לבחון מעגל ביולוגי זה באמצעות הקלטות המבוצעות עם אלקטרודות חיצוניות. האזור הפעיל של תא העצב, שבו נכנסים יונים, פועל כמקור מתח; זרם זורם מאזור זה לאורך פנים התא, וחוזר דרך התמיסה החיצונית. לפיכך, בין שתי נקודות בממברנה השונות בפוטנציאל שלהן קיימת זרימת זרם, שחייבת להיות זהה בתוך הסיב וכמחוצה לו; כיוון שההתנגדות בפנים גדולה מזו שבחוץ, מפל המתח הגדול ביותר מתרחש כאן.

התבוננו במערכת ובמעגל השקיל שלה (איור 4: א' וב'):
דיאגרמת מדידת זרם בתא עצב, המראה חיבורי אוסצילוסקופ, ונתיבי התנגדות של Ro ו-Ri.
מעגל שקיל:
סכימת מעגל עם מקור מתח של 120 mV, נגדים Ro ו-Ri, ואוסצילוסקופ; מודד מתח וזרימת זרם.
איור 4: א' (למעלה). זרימה חשמלית של זרם דרך ממברנה של תא ביולוגי. ב' (למטה). מעגל חשמלי שקיל. מקור המתח (120 mV) הוא מתח ממברנה הנוצר על ידי פוטנציאל הפעולה של תא העצב.
הערה: R0 ו-Ri נמצאים למעשה בטור (ולא במקביל) בשל מיקומו של מקור המתח. שרטוט שקיל של המעגל הוא כדלקמן:
סכימת מעגל אלקטרוני; מחלק מתח, נגדים \(R_0 = 10^4 \Omega\), \(R_t = 10^6 \Omega\).
איור 5: מעגל חשמלי שקיל חלופי לאיור 4א'.

תרגיל 4.
נתון כי:
Vm, פוטנציאל לאורך הממברנה = 120 mV
Ri, התנגדות הנוזל הפנימי = 106 Ω
R0, התנגדות הנוזל החיצוני = 104 Ω
חשבו את V0, הפוטנציאל בין אלקטרודות A ו-B.
V0: ________________V

תרגיל 5.

באמצעות רשת 4 (ראו להלן), מדדו את הפוטנציאלים על פני כל נגד (R0 ו-Ri).
רשת 4. חברו נגדים של 4.7 K Ω ו-10 K Ω בטור עם מקור מתח של 1.5 V:
דיאגרמה של מעגל עם סוללה של 1.5V, נגדים של 4.7KΩ ו-10KΩ, המדגימה רשת חשמלית.
מדדו את המתחים באמצעות הוולטמטר.
מתח (על פני R0): ________________V
מתח (על פני Ri): ________________V

רשת 5 : זהה לרשת 4, למעט R0 = 1 K Ω
שימו לב שברשת 5, ההתנגדות החיצונית נמוכה בהרבה (בדומה למצב שבו כמות גדולה של נוזל או רקמה לא פעילה יוצרת קצר בין האלקטרודות), ומכאן החשיבות של ביצוע הקלטה מעצבים באוויר או תחת שמן מבודד, כדי להגדיל את ההתנגדות החיצונית.
מתח (על פני R0): ________________V
מתח (על פני Ri): ________________V

1.6) התנגדות ומוליכות בחיבור טורי ומקבילי

דוגמה ליישום ביולוגי:

דוגמה טובה להתנגדויות בטור ובמקבילה היא התצורה החשמלית של סינפסה בעלת תמסורת כימית. תמסורת חשמלית אינה אפשרית ברוב הסינפסות בשל אפקט הניקוז (shunting effect) של המרווח הסינפטי. עם זאת, שים לב כי ניקוז זה הכרחי ככל הנראה כדי לאפשר התפתחות של פוטנציאל גבוה על פני הקרום הפרה-סינפטי, המלווה בשחרור המתווך.

תרשים העברה סינפטית; ממברנה פוסט-סינפטית, נתיב ירי התא, התנגדות חשמלית.
איור 6: מודל של זרימה אלקטרוכימית דרך סינפסה.
תרשים מעגל חשמלי עם נגדים (Rm1, Rm2, Rm3, Rs) לצורך ניתוח רשת.

שימו לב כי ברקמה חיה נוצרים התנגדויות חשמליות משמעותיות בממברנות ובמרחבים חוץ-תאיים מצומצמים. מרחבי נוזלים גדולים יחסית, כגון ציטופלזמה של תא או תמיסות רחצה, אינם מהווים התנגדויות משמעותיות.

תרגיל 6.
רשת 6 (ראו לעיל, ולוח המעגלים) היא אנלוג של סינפסה עם העברה כימית. בסינפסות עם העברה חשמלית, המרווח הסינפטי (התנגדות shunt Rs) אינו קיים והזרם זורם ישירות מהתא הפרה-סינפטי לתא הפוסט-סינפטי דרך Rm1 ו-Rm2, ולאחר מכן דרך Rm3. ניתן למדוד בקלות את הנחייתו של הרשת עם ערכים שונים של נגדים, מה שממחיש שינויים בסינפסות שונות. חברו את ה-PowerLab שלכם למתח של 1.5V (כלומר, הגדרה של 0.75 Volt).

  1. מדדו באמצעות המולטימטר את הפרש הפוטנציאלים (PD) על פני כל נגד ברשת כפי שסופק. רשמו את ערכי הנגדים. רשמו במיוחד את ה-PD על פני Rm3 (הממברנה של התא הפוסטסינפטי). מתח: ________________V
  2. החליפו את הנגד של 330 Ω ב-Rs בנגד של 330K Ω. מדדו את ה-PD ב-Rm3.
  3. כעת, כאשר Rs נשאר בערך של 330K Ω, החליפו את הנגד של 330K Ω ב- Rm2 בנגד של 33K Ω. מדדו את ה-PD על פני Rm3. מתח: ________________V
  4. כעת, כאשר Rs נשאר בערך של 330K Ω ו-Rm2 בערך של 33K Ω, החליפו את הנגד של 22K Ω ב-R m1 בנגד של 220 Ω. מדדו את ה-PD על פני Rm3. מתח: ________________V

תרגיל 7
דוגמה לרשת נגדים בחיבור טור-מקבילי מופיעה כאשר בוחנים את תכונות הכבל של סיב עצב או שריר. קבוע האורך (LENGTH CONSTANT) של סיב הוא המרחק שבו הפרש פוטנציאלים (PD) לאורך הממברנה דועך ל-37% מערכו המקורי. הנחיתה נובעת מההתנגדויות הפנימיות והחיצוניות של הנוזל משני צידי הממברנה, המקוצרות על ידי התנגדות הממברנה הרוחבית (הגבוהה יחסית). ערך ההתנגדות מגביל את העברת האות לאורך אקסון של תא עצב. קבוע האורך הוא 1/e כפי שנמדד עבור דעיכה מעריכית. dE/dT=-E/RC; כאשר E הוא הפרש המתח, R הוא ההתנגדות ו-C הוא הקיבול. או בצורה אחרת E=Eoexp (-t/RC); כאשר Eo הוא מתח ההתחלה ו-t הוא הזמן בשניות. RC מכונה גם טאו (τ), קבוע הזמן.

בהנחה שההתנגדות של הנוזל החיצוני זניחה בהשוואה להתנגדויות התוך-תאיות והממברנליות, ניתן לייצג את התכונות ההתנגדויות הפסיביות של הממברנה באמצעות המעגל הבא:
דיאגרמת רשת נגדים לחישובי קבוע אורך; מציגה ערכי Rm ו-Ri במעגל חשמלי.
דיאגרמת רשת נגדים; הגדרת גששי מתח לחישובי קבוע אורך בניתוח מעגל חשמלי.
מעגל על לוח לחם עם נגדים וחוטים, המדגים הגדרה בסיסית של מעגל חשמלי.
איור 7: יישום של רשת 7 על גבי לוח לחם.

הפעל מתח בקצה אחד של רשת 7 בין A ל-B. השתמש בסטימולטור, ובחר בפולס בעל משך של 1 שניה, אמפליטודה של 1V (הגדר ל-0.5 V) ותדר של 0.75Hz. חבר את הוולטמטר לכל נגד "ממברנה" בתורו, ורשום את הפרש הפוטנציאלים (PD) על פני אותו נגד. השאר קצה אחד של הפרוב של הוולטמטר נייח ב- (A-lead, Red), בעוד הקצה השני מוזז בהדרגה לאורך המיקומים 1-5. שרטט כל ערך על גרף של PD כפונקציה של ה"מרחק" מהמקור, כאשר נגדי הממברנה נמצאים במרחק יחידה זה מזה. קבע מהגרף את קבוע האורך של מעגל זה. הפרש פוטנציאלים לעומת מרחק, גרף; ניתוח שדה חשמלי, מושג בפיזיקה, PD(V).
גרף של רשת 7 אורך קבוע:______________

ההשפעה של עלייה בהתנגדות הרוחבית של הממברנה, כפי שקורה במעטפת מיאלין, או ירידה בהתנגדות הפנימית האורכית של הסיב הנלווית לעלייה בקוטר הסיב, היא שינוי בקבוע האורך. ערכי הנגדים אינם אלו שנמצאים בפועל באקסון של עצב, אך הם פרופורציונליים בקירוב. באופן דומה, "יחידת המרחק" במודל מוגדלת משמעותית בהשוואה לתא עצב אמיתי.

1.7) קיבול

קבלים אוגרים מטען. כאשר מופעל מתח על קבל באמצעות נגד, זרם זורם אל הקבל, ולאחר מכן ה-PD (הפרש הפוטנציאלים) על פני הקבל עולה באופן מעריכי עם הזמן לעבר ה-PD של המקור; מהלך הזמן של שינוי מתח זה תלוי במתח המופעל, בקיבול ובהתנגדות הטורית. מהלך זמן דומה אך הפוך נראה כאשר קבל נפרק.
דיאגרמה של מעגל RC עם נגד של 100K ohm וקבל של 10μF.
חברו את הכניסה של רשת התנגדות-קיבול (RC) פשוטה זו למעבדה שלכם, בנקודות A ו-B. השתמשו בפולסים של 1V (הגדירו ל-0.5V) במשך 1s ובתדר של 0.75Hz. כמו כן, יש להגדיר את קצב הדגימה ל-20 K /sec (בצד ימין של הפאנל). חברו את מלקחי הכניסה מה-PowerLab על פני הקבל. אספו נתונים למשך מספר שניות ולאחר מכן עצרו. השתמשו בחלון ה-Zoom כדי להרחיב את זמן העלייה באחד הפולסים המרובעים. ייתכן שיהיה צורך לחזור על ההגדרה מספר פעמים כדי לפרוש את הגרף. מדדו את זמן העלייה מקו הבסיס ועד לשיאו של גרף המתח בדיוק בנקודה שבה הוא מתייצב. צפו במהלך הזמן של שינוי הפוטנציאל ובסטיות של הפולסים המרובעים. צפו בהשפעה של החלפת הקבל של 10μF בקבל של 0.1 μF. על ידי חיבור גשש המתח של ה-PowerLab על פני הנגד, תוכלו לצפות במהלך הזמן של זרימת הזרם במעגל. אספו מספר פולסים בודדים ולאחר מכן עצרו כדי למדוד. השתמשו בסמן "M" כדי לעבור לקו הבסיס לפני העלייה ובסמן החופשי לנקודה שבה המתח מתחיל להתייצב.

הדוגמה האחרונה כוללת רכיבים התנגדיים וקיבוליים כאחד. תכונות הכבל הפסיביות של סיבי עצב ושריר נקבעות על ידי אלמנטים דומים, הנובעים מתכונות קמי mutants של ממברנת התא. בתא קיים לא רק התנגדות ממברנה רוחבית, אלא גם קיבול ממברנה, בשל התכונות החשמליות של ממברנת התא. השפעתם היא השפעה על מהלך הזמן של התפתחות פוטנציאלים המתפשטים באופן אלקטרוטוני.

דוגמה:
דיאגרמה של מעגל חשמלי לחישובי קבוע אורך; נגדים, קבלים, ניתוח רשת.
ניתן לבנות רשת זו מרשת 7 על ידי חיבור הקבלים הנדרשים במקביל לנגדי הממברנה (Rm).

תרגיל 8.
חברו את הקבלים של 10 μF לרשת 7. באמצעות פולסים מהסטימולטור בערכים של 1s, 1V (הגדרה של 0.5 V) ו-0.75Hz, אשר צריך להיות מחובר בנקודות A ו-B, צפו בשינויי הפוטנציאל על פני כל נגד ממברנה. בהנחה שמתח ה"סף" (המתח שבו נוצר פוטנציאל פעולה בתא עצב) הוא 0.2V, מדדו את הזמן שנדרש כדי שהפוטנציאל יגיע לסף בכל נגד ממברנה. סף, בהקשר זה, פירושו ערך הפוטנציאל שבו יכול להיווצר פוטנציאל פעולה בתא חי. שרטטו את תוצאותיכם כפונקציה של זמן מול 'מרחק'.

מעגל אלקטרוני על לוחבדיקות עבור ניסוי תהודה של RLC, הכולל נגדים וקבלים.
איור 8: יישום של רשת 9 על מערך לוחבדיקות.

תרשים זמן מול מרחק; צירים: מרחק (יחידת אורך), זמן להגעה ל-0.2 V.
גרף עבור איור 8.

דמה את ההשפעה של ירידה בקיבול הממברנה הנובעת מעלייה בעובי נבקי המיאלין, על ידי החלפה לקבלים קטנים יותר של 0.1μF. שים לב לשינוי בזמן הדרוש להגעה לסף בנגד נבחר. הצג את הנתונים על אותו גרף שבו נמצאים הקבלים הגדולים יותר.

במונחים של ממברנת שריר, ניתן לחשוב על קיבוליות מוגברת הנובעת מהגדלת שטח הפנים של הממברנה על ידי ה-T-tubules הנלווים, מה שמוביל לקיבוליות ממברנה גבוהה יותר בהשוואה לנוירון. ניתן להשתמש בקבלים קטנים יותר כדי להדגים את הירידה בקיבוליות כתוצאה מהוספת מיאלין לאקסון של עצב שאינו מיאליני. הנקודה המרכזית שיש ללמוד כאן היא שהקיבוליות החשמלית פרופורציונלית לשטח הפנים, וביחס הפוך לעובי השכבה הדיאלקטרית (מיאלין) המפרידה בין ה"לוחות" או משטחי האחסון של הקבל.

התכונות המוצגות במעגל מודל נצפות בהכנות חיות. עם זאת, תאים נבדלים בתכונותיהם, כגון דליפה דרך הממברנה והתנגדות צירית. חלק מהתאים אינם מייצרים פוטנציאלי פעולה. מנגד, פוטנציאל פעולה נוצר כאשר יש צורך להעביר אות למרחק של מספר מילימטרים, מכיוון שתכונות חשמליות פסיביות של תאים מרססות אותות לאורך מספר מילימטרים. בסדרת הניסויים הבאה מודגם רישום של פוטנציאלי פעולה.

1.8) שאלות לסטודנטים

  1. מהם כמה מהערכים הנורמליים של קבוע אורך עבור נוירונים ותאי שריר?
  2. מה יקרה אם לממברנה יהיה התנגדות ממברנה נמוכה: האם קבוע הזמן (הזמן עד להגעה ל-63% מהערך הסופי) ישתנה? אם כן, כיצד ישתנה עם התנגדות ממברנה נמוכה יותר? מהי הנוסחה המתמטית הכללית עבור קבוע הזמן (tau)?
  3. מדוע אקסונים גדולים יותר, כגון האקסון הענקי של הדיונון, יכולים להעביר אותות חשמליים מהר יותר מאשר אקסונים קטנים יותר באותה הכנה של דיונון?

2. תכונות ההולכה של תאי עצב

2.1) מלוח לחם לתאים חיים

ניתן למדוד בתאי חיים גם את התכונות הפסיביות שהודגמו בתרגילי לוחות המעגלים; עם זאת, הפרדת התכונות הפסיביות הללו עשויה להיות מורכבת כאשר הן מלוות בפוטנציאלי פעולה בתאי עצב. התכונות האקטיביות של הנוירון הן היכולת שלו לשמר פוטנציאל ממברנה במצב מנוחה, לייצר פוטנציאלי פעולה ולהנחיתם לאורך מקטע של הממברנה.

זרימה חשמלית לאורך חוט עצבים יכולה להיות גם רגנרטיבית בתוך נוירונים בודדים ומנוירון אחד למשנהו. בחוט העצבים הגחוני (VNC) של סרטן הנהר, חלק מהנוירונים מתקשרים באמצעות צמתי מחיצה (כלומר, gap junctions). כפי שהודגם בתרגילים קודמים עם לוח הבדיקות (bread board), שינוי ההתנגדות יכול להפריע להולכה של אותות חשמליים. דבר זה אנלוגי לשינוי זרימת הזרם דרך צמתי פער בתוך חוט העצבים הגחוני.

בסדרת הניסויים הבאה נבחן את מהירות ההולכה ומאפיינים נוספים של פוטנציאל הפעולה המורכב ב-VNC. נדגים כיצד להוציא את ה-VNC לצורך ניסוי וכיצד לעורר ולמדוד את התגובות באמצעות ציוד סטנדרטי המיועד למעבדות לימודיות לסטודנטים.

2.2) הכנת הסרטן

חוט העצבים הגבי (ventral nerve cord) של סרטן המים הוא המתאים ביותר לניסוי זה. ניתן להוציא את העצב בקלות, ומגוון פרוטוקולים המשפיעים על ההולכה ניתנים ליישום בהכנה זו. לפני תחילת הניסוי, הכירו את מונחי האנטומיה של סרטן המים המפורטים להלן:
דיאגרמה אנטומית של סרטן; אזורים מסומנים: ראש-חזה (cephalothorax), בטן, גפיים.
איור 9. דיאגרמה כללית של אנטומיית סרטן המים.
עובד מ: http://www.enchantedlearning.com

2.3) רקע על הולכה בעצב

חוט העצבים הגבי (ventral nerve cord) של סרטן הנהר מתפקד בהעברת אותות המפעילים תגובות בריחה, כגון תגובת ההדף של הזנב. בניסוי זה, ההקלטות יבוצעו מכל חוט העצבים השלם והבלתי פגוע. הפוטנציאלים האינדיבידואליים מכל נוירון בתוך חוט העצבים מסתכמים יחד ליצירת פוטנציאל פעולה מורכב (compound action potential), המספק את הפולסים החשמליים המדידים המוצגים על ידי תוכנת ההקלטה. Erlanger, Gasser, and Bishop (1924) הם מהחלוצים שתיארו פוטנציאלי פעולה מורכבים. מוצגים מאפיינים של תקופת הרהפוקטוריות, מהירות ההולכה וההשפעות העצביות של מעכב צומתי הפער (gap junction inhibitor) 1-heptanol או של הטמפרטורה. למידת העקרונות הבסיסיים של אותות תאי עצב תורמת להבנה טובה יותר של התפקוד הנוירולוגי באופן כללי (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe and Grundfest, 1961).

2.4) חומרים

פריטכמות
סרטן נחלים גדול (Procambarus clarkii)1
מספריים לדיסקציה מדויקת1
פינצטה1
MLT016/X Nerve Chamber1
מחשב נייד עם תוכנת Scope1
PowerLab1
מגבר PowerLab1
כבל יציאה של סטימולטור עבור PowerLab1
מחבר USB בין PowerLab למחשב1
מעמד מניפולטור עם אלקטרודת יניקה1
פיפטת זכוכית עם נורית שאיבה1
ביקר עם תמיסת סליין לסרטני נחלים1

2.5) שיטות

2.5.1) דיסקציה

יש לוודא כי צלחת העצבים, כלי העבודה השונים והתמיסות מוכנים לפני ביצוע הנשח של סרטן נהר.

  1. עטפו את הסרטן בנייר סופג לח כדי להחזיקו, או פשוט החזיקו את הסרטן ביד אחת כאשר הצבתים (chelipeds) נמצאים בין האגודל לאצבע המורה.
  2. באמצעות היד השנייה, בצעו חתך עם מספריים דרך ה-rostrum בין שקעי העיניים.
    תהליך נתיחה של סרטן עם מספריים, מחקר אנטומי, חינוך ביולוגי.
  3. חתכו כלפי מטה מהחתך עד שהראש מופרד לחלוטין.
  4. בצעו חתך בבסיס ה-cephalothorax מעל הבטן; הסירו את הזנב. (במידת הצורך, ניתן להסיר את ה-chelipeds ואת רגלי ההליכה כדי להקל על תהליך זה).
    תהליך נתיחה של חרק המוצג בניסוי במעבדה לאנטומיה עם מערך לבדיקה מיקרוסקופית.
  5. הסירו את רגלי השחייה (swimmerets).
    נתיחה אנטומית של עקרב, התמקדות במבנה השלד החיצוני, הצגת הצבתים והגוף המגמנט.
  6. בצעו חתך לאורך שני הצדדים של הצד הגבוני (ventral) של הבטן. היזהרו לא לפגוע ברקמות עמוקות יותר.
    נתיחת חרק; מחקר אנטומיה של לרובה; ניסוי במעבדה עם סכין מנתחים; מחקר חינוכי.
  7. קלפו לאחור את חלק השלד החיצוני המשוחרר עד לבסיס מניפת הזנב כדי לחשוף את חוט העצבים הגבוני.
    תהליך נתיחה של חסר חוליות; ניסוי בביולוגיה; מחקר אנטומי; שיטת מחקר.
  8. באמצעות קצה הפינצטה, הסירו בזהירות את חוט העצבים הגבוני מהקצה. היזהרו לא למתוח או למעוך את חוט העצבים. (כל בליטה הנצפית על חוט העצבים היא גנגליון של הסרטן).
    הידרודינמיקה בשיווי משקל סטטי, מיקרואורגניזם, תת-מימי, תצפית מדעית, תרשים.
  9. פרסו את חוט העצבים על פני מוטות המתכת בתא העצבים. חיוני לשמור על חוט העצבים הגבוני לח. כדי להשיג זאת, הוסיפו לתא העצבים מספיק תמיסת סלין לסרטנים עד לגובה המוטות המתכתיים. לאחר מכן, שאבו בעזרת פיפט מספיק תמיסת סלין לסרטנים כך שגובה הנוזל יגע רק בתחתית המוטות.
    סלין לסרטנים (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl2.2H2O; 2.45 MgCl2.6H2O; 5 HEPES מותאם ל-pH 7.4)
  10. מרגע שהעצב במקומו, חברו את כבל הגירוי עם שני מוביעי המיני-הוק לתא העצבים. חברו את המוביל האדום החיובי לאחת הלולאות המתכתיות החיצוניות ליד קצה חוט העצבים; חברו את המוביל השחור השלילי ללולאת המתכת הסמוכה ביותר שעדיין נמצאת במגע עם חוט העצבים.
    עירור אופטי במערך ספקטרוסקופיה; ניתוח פוטוני; מחקר פליטה ובליעה.
  11. מקמו את אלקטרודת השאיבה בתוך המניפולטור ליד הקצה הנגדי של העצב.
  12. שאבו בזהירות את קצה חוט העצבים הגבוני לתוך אלקטרודת ההקלטה.

2.5.2) הקלטה

לאחר שקצה חוט העצב נשאב לתוך אלקטרודת ההקלטה, ודאו שהאלקטרודה מחוברת לגשש ושהגשש מקוcurrentPlayer באופן מספיק. ניתן לבצע זאת פשוט על ידי חיבור כבל ההארקה לכלוב פאראדיי. יש לחבר גם את חוטי אלקטרודת השאיבה החיובית והשלילית למיקומים המתאימים בגשש. את הגשש יש לחבר למגבר הדיפרנציאלי, אשר מחובר בתורו ל-PowerLab.
הסדרת ניסוי במדעי העצבים עם כלוב פאראדיי, מיקרוסקופ, אלקטרודות ומערכת הגברה.

חברו את החוטים החשמליים מאלקטרודת היניקה (suction electrode) לשלב הראש (head stage). יש לחבר את החוטים כך שהחוט האדום (חיובי) יהיה בפינה השמאלית העליונה, החוט הירוק (הארקה) במרכז, והחוט השחור (שלילי) למטה. הדבר מודגם באיור 10 עבור שלב הראש להלן. ניתן להניח את חוט ההארקה בתוך אמבט הסלין. כך, חוט אחד מאלקטרודת היניקה יחובר לכניסת ה- + והשני לכניסת ה- -. אין חשיבות לאיזה מהחוטים מאלקטרודת היניקה יחובר לכניסות ה- + או ה- -.
דיאגרמת סימני מטען חשמלי; סימנים חיוביים ושליליים, מחוון ירוק.
איור 10: כניסות עבור שלב הראש

הגדרות המגבר הן כדלקמן:

בקרָההגדרה
מסנן מעביר גבוה (High Pass)DC
מסנן חסימה (Notch Filter)OFF
מסנן מעביר נמוך (Low Pass)20kHz
פיצוי קיבול (Capacity Comp.)נגד כיוון השעון
כפתורי כיוון עדין וגס של היסט DC (DC Offset)נגד כיוון השעון
היסט DC (+OFF)OFF
כפתור הגברה (Gain)50
כניסה (DIFF MONO GND)DIFF
מצב (MODE (STIM-GATE-REC))GATE
בדיקת התנגדות (ΩTEST)OFF

חברו את כבל ה-USB המסופק לגב ה-PowerLab ולשקע במחשב. פתחו את תוכנת ה-Scope משולחן העבודה של המחשב. בפינה הימנית העליונה של המסך, בחרו ב-"Channel 2" וכבו אותו. התאימו את המסך כך שרק Channel 1 יוצג, על ידי גרירת הסרגל שבמרכז המסך כלפי מטה. לאחר מכן, לחצו על ה-"Input Amplifier" עבור channel 1 בפינה הימנית העליונה של המסך. בחרו באפשרויות הבאות:

ביקורתמסגרת העבודה
טווח500 mV
זרם חילופיןנבדק
מעבר נמוךכבוי
קצה בודדנבדק
הפוךנבדק

בשלב הבא, שוב תחת "Set up", לחצו על "Sampling". בתיבה שכותרתה "Sweep" שמופיעה על המסך, בחרו את הדברים הבאים:

בקרהגדרה
מצבמרובה
דגימה100 SWEEPS
מקורמשתמש
השהיה0 SECONDS

לבסוף, תחת הלשונית "Set up", בחרו ב-"Stimulator". לחצו על התיבה כדי לבטל את "Isolated Stim". בחרו את ההגדרות הבאות:

בקרההגדרה
מצבמרובה
עיכוב5 מילישניות
משך זמן1 מילישנייה
פולס(ים)2
מרווח15 מילי-שניות
טווח5 V
אמפליטודה0.5
  
  

ראו את "Time Base" בפאנל הימני. שנו את "Sample" ל-1024 ואת "Time" ל-200 msec.

גרף אלקטרופיזיולוגיה, פוטנציאל פעולה, קפיצת מתח, ניתוח נתונים, תוצאת מחקר.
איור 11: שני פוטנציאלי פעולה מורכבים עם מרווח של 15 msec בין הגירויים כפי שהוקלטו באמצעות תוכנת ה-Scope.

תרגיל 1.

לחצו על כפתור ה-"Start" בפינה השמאלית התחתונה של המסך. בהינתן ההגדרות שלעיל, פוטנציאל פעולה מורכב המוגדר בבירור אמור להופיע בתיבת איסוף הנתונים של ה-Scope (איור 11). שרטטו את הצורה הכללית של פוטנציאל הפעולה בגרף למטה (איור 12):
גרף שיווי משקל סטטי, תרשים מתח לעומת זמן, המציג שינויי mV לאורך מילישניות.
איור 12: גרף ריק לשרטוט צורתו של פוטנציאל פעולה מורכב.

הפחיתו לאט את המתח באמצעות הלשונית בפינה השמאלית העליונה של המסך. גודל פוטנציאל הפעולה אמור להקטן עד שגם דפוס הגל האופייני שלו ייעלם. הפחתת המתח מקטינה את מספר הנוירונים שגויסו להפעלת פוטנציאל הפעולה המורכב. סביר להניח שהאקסונים הגדולים יותר מגויסים במתחים נמוכים יותר והם בעלי הולכה מהירה יותר, ולכן הם נוטים להופיע ראשונים בפוטנציאל הפעולה המורכב. הגבילו את המתח בעלייה הדרגתית כדי לצפות באפקט ההפוך; ככל שנוירונים נוספים מגויסים, גל פוטנציאל הפעולה המורכב גדל. תרגיל זה ממחיש את העובדה שלנוירונים בודדים יש ספי סף שונים להפעלת פוטנציאל פעולה. כאשר פוטנציאל הפעולה המורכב אינו גדל יותר עם העלאת מתח הגירוי, משמעותו היא שכל הנוירונים גויסו; במצב זה צריכים להיראות שני שיאים מובחנים בגל פוטנציאל הפעולה על מסך המחשב.

תרגיל 2.

לאחר בחינת גיוס הנוירונים ופוטנציאל הפעולה המורכב הנוצר, התבוננו בהשפעת תקופת הזיכרון (refractory period). ניתן לעשות זאת על ידי מתן שני גירויים בפרק זמן קצר, תוך שינוי המרווח בין הגירויים, ולאחר מכן בחינה באיזה מרווח זמן פוטנציאל הפעולה המורכב, שנוצר על ידי הגירוי השני, מופחת באמפליטודה בהשוואה לפוטנציאל הפעולה המורכב הראשון. שנו את ההשהיה בין הפולסים באמצעות הלשונית בפינה השמאלית העליונה של המסך. המשיכו לקצר את ההשהיה עד שלא ניתן יהיה לעורר פוטנציאל פעולה מורכב שני. הזמן בין הפולסים שבו לא ניתן לעורר יותר פוטנציאל פעולה שני הוא תקופת הזיכרון המוחלטת. הזמן שבין סיום תקופת הזיכרון המוחלטת לזמן שבו גירוי שני יוצר פוטנציאל פעולה באמפליטודה מלאה נקרא תקופת הזיכרון היחסית. ספקו הערכה של תקופות הזיכרון המוחלטת והיחסית במקומות המיועדים לכך.
תקופת זיכרון מוחלטת: ___________________
תקופת זיכרון יחסית: ___________________

2.5.3) מדידת מהירות ההולכה

בעזרת סרגל מילימטרים, מדדו את המרחק בין חוט העירור הקרוב ביותר לאלקטרודת הרישום לבין אלקטרודת הרישום. מתוך העקבה המרושמת, מדדו את הזמן עד לשיאים השונים של האירועים בפוטנציאל המורכב, כדי שתוכלו לרשום את מהירות ההולכה של האותות החשמליים השונים. המירו את המרחק ממילימטרים למטרים ואת הזמן ממילי-שניות לשניות, כדי לקבל יחידות של מטרים לשנייה.
1נא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. מהירות הולכה של צורת הגל: __________________
2נד מהירות הולכה של צורת גל: __________________
3rd מהירות הולכה של צורת גל: __________________
4th מהירות הולכה של צורת הגל: __________________

2.5.4) מניפולציה של צומתי הפער (gap junctions) ו/או של מהירות ההולכה

לאחר מכן, בחנו את תכונותיו של מעכב נוירונלי. השפעת הניתוק (uncoupling effect) של הפטנול תוארה לראשונה על ידי Johnston באקסונים מופרדים (septate axons) של סרטנים (כלומר, צמתי פער - gap junctions). ושות' (1980). אפקט זה, הקשור לתקשורת חשמלית, אושש במהרה במערכות שונות של חולייתנים וחסר-חולייתנים (Bernardini ואח'., 1984; Meda ואחרים., 1986). כדי להבין את תפקידה של התקשורת החשמלית בחבל עצבים ונטרלי זה, ניתן להשתמש בתמיסת מלח הכוללת (1mM) 1-heptanol כדי לבטל את הצימוד של צמתי הפער (gap junctions). בעזרת פיפטת זכוכית, שטפו את כל חבל העצבים בתמיסת heptanol. התבוננו בשינוי הנרשם על ידי תוכנת ההקלטה Scope וסכמו אותו (שימו לב לשינוי בצורת הגל, והאם מהירות ההולכה של צורות הגל השתנתה). לחלופין, במקום להשתמש ב-1-heptanol, ניתן להחליף את תמיסת הרחצה בתמיסת מלח קרה מאוד (בטמפרטורת קרח) ולנטר כל שינוי בצורת הגל או במהירות ההולכה של צורות הגל.

דיון

המטרה שלנו במצגת on-line את הווידאו הזה הנייר כדי להוכיח את מאפייני biophysical של תאים יכולים, בין השאר, להיות המודל כמו מעגלים חשמליים. בנוסף, עם רקמה עצבית לחיות כי הוא יחסית להשיג בקלות, עקרונות היסוד של מהירות ההולכה, תקופות עקשן וטכניקות הקלטה אלקטרו אפשריים עבור מעבדות סטודנט לתואר ראשון עם השקעה צנועה של ציוד. נושאים ופרדיגמות היסוד שהוצגו ניתן לשנות בקלות את הדרישות של קורסים שונים.

תחזוקה של סרטנים ושפע שלהם הופך אותם מודלים אטרקטיבי עבור ניסויים סטודנט מונחה. מיתרי סרטנאים עצב הגחון הם בדרך כלל חזקים ולשמור על שלמות פיזיולוגיים מלוחים מינימלית במשך שעות, וזה מתאים במעבדה סטודנט 3 שעות.

בהינתן כי חלק מן האקסונים גדולים VNC של סרטנים מחוברים דרך צמתים הפער, ניסויים נוספים על תרומתם ניתן לבצע ומאפיינים שונים מאשר למצוא את הכנת צפרדע רגיל עצב השת ניתן להדגים. עצב השת הוא מודל קלאסי לטיפול פעולה מתחם הפוטנציאלים ומאפיינים הולכה. זה יכול להיות גם ניסוי השוואתי מעניין לסטודנטים להשוות תכונות הולכה, גיוס האקסון, ותקופות עקשן בין שתי ההכנות.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

ניסויים אלה שונו מן ידני מעבדה, שבו נעשה שימוש בקורס, בניצוחו של ד"ר HL אטווד, במחלקה לזואולוגיה, אוניברסיטת טורונטו. תרגילים שימשו גם שונה מן מדריך זה הופק עבור "הסדנה 6 ה IBRO אינטנסיבי BASIC Neuroscience" ו נערך באוניברסיטת קוריאה, סיאול, דרום קוריאה בשנת 1993 (Cooper et al. 1993). שינויים הנוכחית נדרשו להשתמש בציוד משותף להציג יום הסטודנט במעבדות מכוונת באוניברסיטאות שונות. נתמך על ידי אוניברסיטת קנטקי, החוג לביולוגיה, משרד לימודי הסמכה ו במכללה לאמנויות ומדעים.

חומרים

המעגלים

  1. אלקטרוניקה המפורטים להלן עבור הניסויים קרש החיתוך ניתן להשיג בחנות האלקטרוניקה המקומית כגון רדיו שאק.
  2. הלוח לחם, נגדים, קבלים, סוללות וחוטים שיכולים לשמש עבור צמתים קרש החיתוך כפי שמתואר הניסויים.
  3. וולטמטר משותף (Wavetek Meterman וולטמטר)
  4. A / D הלוח על קו ההקלטה למחשב. אותות חשמל נרשמות על הקו לממשק PowerLab/4s (ADInstruments, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה"ב). אנו משתמשים בתוכנה מבית תקן ADInstruments בשם תרשים או היקף.

פיזיולוגיה ניסויים

  1. סרטן הנהרות (Procambarus כלארקיי). Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג'לס., ארה"ב.
  2. תקן סרטנים מלוחים: השתנה מפתרון של ואן Harreveld (1936). (מ"מ) 205 NaCl, KCl 5.3, 13.5 CaCl 2 2H 2 O, 2.45 MgCl 2 6 שעות 2 O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4. כימיקלים כל מלוחים התקבלו Sigma כימיים החברה (סנט לואיס, מיזורי).
  3. Dissection כלים: פיין # 5 פינצטה, מספריים בסדר, בעל להב סכין, # 26002-20 סיכות חרקים (להשיג כל כלי מן המדע פיין (ארה"ב), Inc, 373-G Vintage פארק דרייב, פוסטר סיטי, קליפורניה 94404-1139)
  4. תא עצב צלחת (ADInstruments, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה"ב) כדי להחזיק את העצב. החוטים שמגיעים עם המנה תא העצב יכול לשמש כדי לגרות את העצב.
  5. אלקטרודה יניקה משמש כדי להקליט את האותות.
  6. מניפולטור או מהדק על דוכן טבעת ישמש גם מחזיק את האלקטרודה יניקה.
  7. פאראדיי קייג'
  8. הביתור מיקרוסקופ
  9. עוצמת הפנס גבוהה (מקור האור)
  10. מיקרוסקופ רציף
  11. AC / DC דיפרנציאלי מגבר (AM דגם מערכות בע"מ 3000)
  12. PowerLab 26T (מכשירים לספירה)
  13. מגבר תאיים (מכשירים לספירה)
  14. LabChart 7 (ADI מכשירים)
  15. הביתור כלים
  16. טבעת לעמוד מהדק לשמש בעל עבור האלקטרודה יניקה הקלטה

מקורות

  1. Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6, 305-320 (1991).
  2. Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling. European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).
  3. A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).
  4. Cragg, B. G., Thomas, P. K. The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers. Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).
  5. Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph. American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).
  6. Furshpan, E. J., Potter, D. D. Transmission at the giant motor synapses of the crayfish. Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).
  7. Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. Interaction of anesthetics with electrical synapses. Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).
  8. Loewenstein, W. R. Permeability of membrane junctions. Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).
  9. Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase. Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).
  10. Peracchia, C. Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration. Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).
  11. Peracchia, C., Dulhunty, A. F. Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling. Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).
  12. Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability. Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).
  13. Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH. Sciences NY. 211, 712-715 (1981).
  15. Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).
  16. Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. Gating of gap junction channels. Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).
  17. Watanabe, A., Grundfest, H. Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons. Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).
  18. Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii. Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Breadboard

מאמרים קשורים