ניתוח של בתאי גזע pluripotent באמצעות Cryosections של גופים Embryoid

Summary

בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.

Abstract

גזע עובריים (ES) התאים הם תאים שמקורם pluripotent מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט בשלב עוברי מוקדם יונקים ^1. שלב מכריע התמיינות של תאים עובריים היא היווצרות של גופים embryoid (EBS) אגרגטים ^{2, 3.} היווצרות EB מבוסס על צבירת ספונטנית כאשר תאים עובריים הם בתרבית צלחות חסיד לא. תלת ממדי משחזר EB היבטים רבים של יונקים embryogenesis מוקדם להתמיין שלוש שכבות נבט: האאקטודרם והמזודרם ואת האנדודרם ^4.

Immunofluorescence וב הכלאה באתרו נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות לצורך זיהוי של חלבונים היעד הנוכחי mRNA בתאים של קטע רקמה ^{5, 6, 7.} כאן אנו מציגים טכניקה פשוטה ליצירת cryosections האיכות הגבוהה של הגופים embryoid. גישה זו מסתמכת על האוריינטציה המרחבית של הטבעה EB ב אוקטובר ואחריו הטכניקה cryosection. סעיפים שהתקבל יכולה להיות נתונה למגוון רחב של נהלים אנליטיים על מנת לאפיין אוכלוסיות של תאים המכילים חלבונים מסוימים, RNA או DNA. במובן זה, הכנת EB cryosections (10μm) הם כלים חיוניים לצורך ניתוח מכתים היסטולוגיה (למשל Hematoxilin ו Eosin, DAPI), immunofluorescence (למשל Oct4, nestin) או הכלאה באתרה. טכניקה זו יכולה גם לעזור להבין את ההיבטים של העובר ביחס לשמירה על מבנה תלת מימדי כדורית של EBS.

Protocol

1. קיבוע ו cryopreservation

בתאי גזע pluripotent היו בתרבית על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C ומתוחזק DMEM/F12 בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR) ו 8ng / mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2). על מנת לגרום להיווצרות תאים EB H9 הועברו לא חסיד כלים בתרבית למשך 7 ימים, נשמר DMEM/F12 בתוספת 15% KSR ^8.

שים לב (!): טכניקה זו ניתן להשתמש EBS נגזר כל עובריים ו המושרה גזע pluripotent.

1. אסוף את EBS מצלחת התרבות עם טפטפת.
2. העברת EBS על צינור חרוטי 15 מ"ל ולהמתין החומר שוקע לתחתית הצינור.
3. הסר בינוני ולתקן EBS עם paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   שים לב (!): עבור התאוששות הכלאה באתרו אנטיגן צריך להיעשות על מנת למנוע תגובה קישור לחצות עם נוגדנים עקב השימוש של PFA ^6,7.
4. הסר פתרון PFA ולשטוף עם PBS עבור 5 דקות.
5. EBS יש להציב דילול סדרתי של PBS שנאגרו פתרונות סוכרוז (10, 20 ו ברצף, 30%) ב 25-28 מעלות צלזיוס, כל פתרון חייב להיות מוחלף כל 30 דקות. חומר אז יכול להיות מצויד בפתרון סוכרוז 30% ב 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הטבעה עם אוקטובר

2. הטבעת רקמות, הדרכה הקפאת

6. בזהירות לאסוף את EBS מהצינור. ככל פריקה סוכרוז פתרון האפשרית.
   
   שים לב (!): חשוב להרטיב את הקיר הפנימי של קצה עם פתרון סוכרוז לפני איסוף EBS. הליך זה יכול להימנע EB להיות מחוברת בקצה.
7. המקום EBS במתכונת ולהסיר פתרון סוכרוז שנותרו עם נייר סינון.
   
   שים לב (!): חשוב לא למלא את התבנית עם EBS, כדי למנוע חפיפה.
8. מלא עובש עם אוקטובר לאט, נזהרת שלא מחדש להשעות את EBS. אחרי זה, במקום כל EB במרכז התבנית ולהסיר בועות עם פיפטה.
9. המעטה להתסיס במשך 15 דקות.
10. הקף את התבנית עם קרח יבש כתוש להקפיא את המדגם. אוקטובר אמור להיות קפוא לחלוטין. בשלב זה חוסם יכול להיות מאוחסן ב -70 ° C, למשך שנה אחת לפחות.

3. Cryosectioning טכניקה

11. הסר את גוש קפוא מ -70 מעלות צלזיוס ומניחים על cryostat מקורר בעבר בין -18 ו -21 בטמפרטורה ° C.
    
    שים לב (!): הטמפרטורות מחוץ לטווח זה עלול לגרום לבעיות כמו קטעי מסתלסל, נמס או פיצוח.
12. ניתוק לחסום אוקטובר מהתבנית ומניחים אותה לתמוך cryostat ידי הוספת אוקטובר יותר.
13. חשוב לכוון את הבלוק שצריך ליישר אותו במקביל קצה הלהב.
    
    שים לב (!): כפי EBS הם קטנים יותר מאשר דגימות רקמות אחרות, שלב זה חשוב מאוד כדי להקטין את איבוד של חומר.
14. בלוקים אוקטובר אמור להיות מחולק באופן שטחי עד המטוס משטח מתקבל. סעיפים דק (10μm) של הדגימה רקמות חייב להילקח ועלה על שקופיות הזכוכית מצופה בעבר עם 200 מ"ג / מ"ל פולי L ליזין (10 μL לכל שקופית) ^9,10.
    
    שים לב (!): כדי להימנע בסעיפים torned לשים לב לנזקים בבית הלהב.
15. כל הסעיפים צריכים להיות באוויר יבש לשעה 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשמש או מאוחסנים -70 ° C עד השימוש.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מספק קל לעקוב אחר פרוטוקול להשיג PFA סעיפים קבועים cryostat דקה של גופים embryoid שימושי immunofluorescence וב מבחני הכלאה באתרה. Cryosections וכתוצאה מכך לאפשר חקר היבטים תאית ומולקולרית של האדם התמיינות בתאי גזע עובריים, תוך שמירה על המבנה שלהם בארגון כמו אגרגטים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D (+) מגיב סוכרוז		Vetec	228
מגיב פרפורמלדהיד		Rieden-de Haë n	16005
מגיב תמיסת PBS		LGC Biotecnology	13-30259.05
מגיב פולי-L-ליזין הידרוברומיד		Sigma-Aldrich	P2636	200 מ"ג/מ"ל במים
Tissue-Tek O.C.T. מגיב תרכובת		Sakura Finetek	P2636
מגיב			תמיסת סוכרוז	10% תמיסת סוכרוז ב-PBS w/v
מגיב			תמיסת סוכרוז	20% תמיסת סוכרוז ב PBS w / v
מגיב			תמיסת סוכרוז	30% תמיסת סוכרוז ב PBS w / v
כלי צינור חרוטי		טכנו מוצרי פלסטיק	91015	15 מ"ל צינור חרוטי
שייקר צלחת	כלי	ביומיקסר
Cryostat	כלי	Leica Microsystems	CM 1850
עובש לפלטפורמת OCT	כלי			פלטפורמת פלסטיק פלטפורמה