אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הקלטת כל תא תיקון מהדק של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים היקפי mononuclear תאים שמקורם בדם אנושי לימפוציטים-T.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Whole Cell-הקלטה של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T
במאמר זה
סיכום
תקציר
ב לימפוציטים מסוג T, דלדול של Ca 2 + מ תאיים Ca 2 + חנות מוביל ההפעלה של plasmalemmal Ca 2 ערוצים +, שנקרא שחרור המופעל סידן סידן (CRAC) ערוצים. ערוצי CRAC לשחק תפקיד חשוב בוויסות של התפשטות תאים T ו ביטוי גנים. חריגה פונקציה CRAC ערוץ בתאי T נקשר חמורה כשל חיסוני ומחלות אוטואימוניות וכן בשילוב 1, 2. לימוד פונקציה ערוץ CRAC בבני אדם בתאי T עשויה לחשוף המנגנונים המולקולריים חדש המסדיר התגובות החיסוניות נורמלי לפענח את הגורמים מחלות אנושיות בנושא. הקלטות של זרמים אלקטרו קרום לספק הערכה מדויקת ביותר של נכסים ערוץ פונקציונלי ורגולציה שלהם. הערכה של זרמים אלקטרו CRAC ערוץ Jurkat בתאי T, לוקמיה האדם T שורת תאים, בוצעה לראשונה יותר מאשר לפני 20 שנה 3, לעומת זאת, מדידות CRAC הנוכחי נורמלי בתאי T אנושיים נותר משימה מאתגרת. הקשיים ברישום זרמי CRAC ערוץ נורמלי בתאי T הן מורכב על ידי העובדה דם הנגזרות לימפוציטים מסוג T הם הרבה יותר קטנים בגודל מאשר תאים Jurkat T, ולכן אנדוגני כל תא זרמים CRAC נמוכים מאוד משרעת. הנה, אנחנו נותנים הליך צעד אחר צעד שאנחנו משתמשים באופן שגרתי להקליט את Ca 2 + או Na + זרמים דרך ערוצים CRAC ב נחים אדם בתאי T מבודדים מהדם ההיקפי של מתנדבים בריאים. השיטה המתוארת כאן אומצה מהנהלים המשמש הקלטה הזרמים CRAC בתאי T Jurkat והופעל אדם בתאי T 4-8.
פרוטוקול
1. הכנת מנוחה לימפוציטים T האדם
- שימוש RosetteSep קוקטייל האדם T Cell העשרה צפיפות בינונית RosetteSep, לטהר בתאי T דגימות דם אדם על פי הוראות היצרן. אוכלוסיית התאים וכתוצאה מכך אמור להכיל 95% CD3 + T תאים נחים. אנו לטהר לימפוציטים מסוג T האדם מן דגימות דם היקפיים שנאספו מתנדבים בריאים בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת UC Davis סקירה פנימית.
- לאחר בידוד, resuspend בתאי T מנוחה בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום תרבית תאים המכיל RPMI-1640 בינוני עם גלוטמין ו HEPES, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
החקירה של זרמים אלקטרו CRAC ב נחים אדם בתאי T היא משימה מאתגרת כי משרעת אנדוגני הנוכחית CRAC בתאים אלה הוא קטן בשל גודל תאים קטנים (בקוטר מנוחה האדם T התא בטווח של 5-8 מיקרומטר). כאן, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד באופן מהימן שיא זרמים CRAC בבני אדם לימפוציטים T מנוחה מבודדים תאים דם היקפיים mononuclear. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקור את הפיזיולוגיה ביטוי פונקציונלית של ערוצי CRAC בתאי T מנוחה כדי להבין טוב יותר את מהות נורמליים ופתולוגיים התגובות תא החיסון. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנחנו אסירי תודה על המחלקה לפיזיולוגיה ממברנה לביולוגיה, אוניברסיטת קליפורניה דייויס לספק לנו מתקני אווירה מצוינת עבור המחקרים של תעלות יונים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכה להעשרת תאי T אנושיים RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15061 | |
| תווך צפיפות RosetteSep Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | |
| תווך RPMI-in 1640 עם glutamine/HEPES | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| סרום מעגל עגל (Fetal Calf Serum) | Omega Scientific | FB-01 | |
| GlutaMAX-I (תמיסה 100X) | Invitrogen | 35050 | |
| תמיסת ויטמינים RPMI 1640 (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | |
| תמיסת חומצות אמינו 1640 (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | |
| סודיום פירובאט (Sodium pyruvate) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| β-מרקפטו–אתנול | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| אינוזיטול טריספוספט (Inositol trisphosphate) | Sigma-Aldrich | 19766 | |
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| לנתנום כלוריד (Lanthanum Chloride) | Sigma-Aldrich | 262072 | |
| תפסיגארגין (Thapsigargin) | Calbiochem | 586005 | |
| ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| ציפוי הגנה למוליכים למחצה HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning | ||
| שולחן מעבדה לבידוד רעידות בביצועים גבוהים מסדרת 63-500 | Technical Manufacturing Corp. | 63-540 | |
| מגבר patch clamp מדגם EPC 10 עם headstage | HEKA Instruments | ||
| מיקרו-מניפולטור | Sutter Instrument Co. | MP-285 | |
| מיקרוסקופ הפוך Olympus 1X71 עם עדשת שמן 40x | Olympus Corporation | 1X71 | |
| מחשב Windows | Dell | ||
| תוכנת Pulse | HEKA Instruments | ||
| תוכנת Origin לניתוח וגרף מדעי | OriginLab | ||
| מכשיר למשיכת פיפטות Patch | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| זכוכית בורוסיליקאט עם פילמנט (קוטר חיצוני: 1.5mm וקוטר פנימי: 1.10mm) | Sutter Instrument Co. | BF150-110-7.5 | |
| Microforge של Narashige’s | Tritech Research, Inc. | MF-830 | |
| טבעות O-ring מסיליקון | McMaster-Carr | 111 S70 | |
| כיסויי זכוכית (Coverslips) בגודל 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
מקורות
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
