מאמר שיטה
חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי של Plasmodium yoelii והוא החלים על טפילי מלריה אחרים מכרסמים.
וריאציה בתגובה תרופות נגד מלריה ו pathogenicity של טפילי מלריה היא ביולוגיים והחשיבות רפואי. מיפוי הצמדה הוביל זיהוי מוצלח של גנים או לוקוסים הבסיסית תכונות שונות טפילי מלריה של מכרסמים ובני אדם 1-3 4-6. טפיל המלריה Plasmodium yoelii הוא אחד מיני רבים מלריה מבודד מכרסמים אפריקאי פראי הותאם לגדול במעבדות. מין זה מתרבה רבים מן המאפיינים ביולוגית של טפילי מלריה אדם; סמנים גנטיים כגון microsatellite ו מוגבר אורך קטע פולימורפיזם (AFLP) סמנים יש גם פותחו עבור טפיל 7-9. לכן, מחקרים גנטיים טפילי מלריה מכרסם ניתן לבצע כדי להשלים את המחקר על Plasmodium falciparum. הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקות לייצור הכלאה גנטית פ yoelii כי היו הראשונים חלוץ ידי בני הזוג. דוד Walliker, ריצ'רד קרטר, ועמיתיו באוניברסיטה של אדינבורו 10.
חוצה גנטיים פ yoelii ושאר טפילי מלריה מכרסם נערכים על ידי הדבקה של עכברים מ.א.ס. מאסכאלאס עם inoculum המכיל gametocytes של שני שיבוטים שונים גנטית שונה פנוטיפים של עניין על ידי מתן יתושים להאכיל על עכברים נגועים 4 ימים לאחר ההדבקה. הנוכחות של gametocytes זכר ונקבה בדם העכבר הוא אישר מיקרוסקופית לפני האכלה. בתוך 48 שעות לאחר האכילה, ב midgut של היתוש, gametocytes הפלואידים להתמיין הגמטות, הזכרית והנקבית, להפרות, וליצור זיגוטה דיפלואידי (איור 1). במהלך הפיתוח של הזיגוטה לתוך ookinete, המיוזה נראה להתרחש 11. אם הזיגוטה נגזר באמצעות הפריה הדדית בין הגמטות של שני טפילים שונים גנטית, חילופי גנטי (reassortment כרומוזומליות ו צולבות בין תורות אי - אחות chromatids של זוג כרומוזומים הומולוגיים;. איור 2) עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך רקומבינציה של החומר הגנטי בבית הומולוגיים לוקוסים. הזיגוטה עוברת כל שתי חטיבות הגרעיני רצופים, המוביל four גרעינים הפלואידים. Ookinete נוסף מתפתח oocyst. לאחר oocyst מתבגר, אלפי sporozoites (צאצאיו של הצלב) נוצרות ומשוחרר hemoceal יתושים. Sporozoites נקצרים מן בלוטות הרוק ו מוזרק לארח Murine חדש, שבו פיתוח שלב טרום האריתרוציטים ו האריתרוציטים מתרחש. צורות האריתרוציטים הם משובטים ומסווגים לגבי הדמויות להבחין בקווים ההורים לפני הצמדה מיפוי גנטי. זיהומים בקרה של שיבוטים הורים יחידים מבוצעים בצורה זהה הייצור של צלב גנטית.
טכניקות אספטי חייב להיות מיושם על כל החומרים יהיה המנוהלים על בעלי חיים כדי למנוע הכנסת מכוונת של גורמים מזהמים חיצוניים לעכברים שיכול לבלבל את תוצאות הניסוי.
1. זיהום של עכברי מעבדה עם דם בשלב טפילי מלריה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אנו מדגימים את הטכניקות לייצור צלב גנטי המלריה Plasmodium מכרסם yoelii, שגם הוא החלים על ייצור של צלבים גנטי malarias מכרסמים אחרים. זיהומים של עכברים עם שיבוטים אחד ההורים מבוצעים בדרך כלל כדי לקבוע שידור מוצלח של טפילים ההורים על מנת להבטיח כי ההורים הם המוסמכים בייצור הגמטות פונקציונלי לפני ביצוע צלב.
שידור מוצלח באמצעות יתוש מושפע מגורמים רבים, כולל טמפרטורה של insectary, מינים של מלריה טפיל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אנו מודים ד"ר רנדי אלקינס, רובין Kastenmayer, טד טורי, דן לגזור טובי ליהמן על קריאה ביקורתית של כתבי יד. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר החומות של חטיבת המחקר של בין החומות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומיים לבריאות, ועל ידי התוכנית הלאומית למחקר בסיסי 973 של סין, # 2007CB513103. אנו מודים NIAID עירונית עורך ברנדה ריי מרשל לסיוע.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
משלים חומרים:
תחזוקה של עכברי מעבדה
נקבות של זן עכבר מעבדה מולדת BALB / c, בגילאי 5 עד 8 שבועות הישן, הם השתמשו במחקר. עכברים הם שוכנו כלוב סטנדרטי פוליקרבונט מוצק תחתית עם מכסה מתכת בר, מצויד במזין ובקבוק מים. עכברים נשמרים בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° C) על שעה 12:12 אור: מחזור כהה. עכברים מותר להאכיל על 2018S הרלן Teklad גלובל 19% חלבון בתזונה extruded מכרסם (sterilizable; הארלן מ-Teklad) וסיפקה עם שתיית מים כרצונך acidified המודעה. ניסויים בבעלי חיים מתבצעים בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש במכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות תחת פרוטוקול LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד).
תחזוקה של המעבדה יתושים
יתושים הם מהמושבה מעבדה-bred של אנופלס stephensi. המבוגרים נשמרים בכלובים ניילון המשיך בחדר טמפרטורה ולחות מבוקרת (23-25 מעלות צלזיוס למשך Plasmodium Plasmodium chabaudi yoelii ו, ו 19-21 ° C עבור Plasmodium berghei; 80-95 לחות%; ב 12:12 שעות אור: מחזור כהה). יתושים בוגרים ניזונים עם גלוקוז 10% ו 2.00% para-aminobenzoic חומצה (PABA) פתרון בתוספת מים. כדי להשיג איכות גבוהה מבוגרים, 500 הזחלים גדלים בתנאי צפיפות נמוכה ב L 1 של מים מזוקקים בצלחת 3 1000 ס"מ לפתוח מסופק עם כ 1 מ"ג של סודיום ביקרבונט. לאחר הבקיעה, הזחלים מקבלים tetramin אבקה (PETCO) עד שהם להתפתח בשלב גולם והם הועברו הכלובים יתושים בוגרים עבור המתעוררים.
בבדיקה מיקרוסקופית של כתמי דם דק מוכתמים Giemsa כתם
מספריים לגזור את השימוש לנקות את קצה (1.0 מ"מ) של הזנב של העכבר נגועים. מקום אחד ירידה (0.5-1.0 μL) של דם זנב לשקופית טיפוס נקי. עכבר יהיה לעצור את הדימום בתוך 1-2 דקות. המקום שקופיות מפזר נקי על גבי טיפת דם, שמירה על אותה משפחה 45 ° זווית להחליק את הדגימה, ומאפשרים לדם לספוג לרוחב כל מפזר. החזק את השקופית הדגימה לדחוף קדימה את השקופית מפזר במהירות בצורה חלקה לייצר כתם דק. תנו את הסרט דם יבש, ואז לטבול את השקופיות מתנול מוחלט. אפשר להחליק לייבוש באוויר פעם נוספת לפני מכסה אותו עם כתם Giemsa (10% Giemsa צבע במים מזוקקים). לאחר דוגרים הסרטים דם דק 10-15 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף היטב את השקופיות עם מי ברז ולתת לו להתייבש באוויר. בדוק את מספר נגועים בתאי דם אדומים (iRBC; ראה איור 3 עבור המורפולוגיה של RBC נגוע) תחת מיקרוסקופ אור עם שמן טבילה בהגדלה 1000x (עם עדשה אובייקטיבי 100x) ולחשב parasitemia (מספר iRBC ל -100 RBC ספרתי). זנים שונים של טפילי מלריה להשתנות בקצב הצמיחה pathogenicity. מעקב אחר שלב parasitaemias הדם יכול להתבצע 24 שעות לאחר זריקות, תלוי במינון של השלב טפילים בדם מלריה. למשל, בעכברים יהיה מיקרוסקופית חיובית 24 שעות כאשר הוא מוזרק עם 10 7 נגוע RBC intraperitoneally או 10 6 RBC נגוע לווריד.
מדידת צפיפות תא דם אדום
כמו רמות parasitaemias, תא דם אדום (RBC) צפיפות עכברים נגועים משתנה לאורך הקורס של זיהום. צפיפות RBC יש למדוד בתוך 1-2 שעות לפני תחילת הזיהום יחיד ו מעורב לשבט הניסויים השיבוט. קיימות שתי שיטות למדידת צפיפות RBC: ספירה ידנית באמצעות Neubauer hemocytometer ו ספירה אוטומטית באמצעות Cellometer (Nexcelom Bioscience). בשתי השיטות, לסגת 1 μL דם העכבר הזנב באמצעות זכוכית נימי (VWR) ו לדלל ב 10 מ"ל של PBS ומערבבים היטב. כדי להשתמש hemocytometer Neubauer, עומס 20 μL של ההשעיה על hemacytometer. מניחים את hemacytometer על מיקרוסקופ אור עם עדשה 10x אובייקטיבי. Hemacytometer מכיל רשת מחולק 9 ריבועים גדולים, 4 ריבועים גדולים בפינת מחולקים נוספת לתוך 16 ריבועים קטנים. ספור את המספר הכולל של תאים בכל אחת 16 ריבועים קטנים של ארבעה ריבועים בפינה. כדי למנוע הטיה או לספור ספירת התאים חפיפה קו רשת, לספור תא כמו "ב" אם זה חופף את הקווים העליון או ימין "החוצה" אם זה חופף את השורות למטה או שמאלה. אומדן מספר התאים לכל ריבוע אחד קטן ולחלק ידי 0.00625 (נפח של ריבוע אחד קטן הוא 6.25 NL). זה מניב את מספר התאים לכל microliter (&mu, L). מתוך נתונים אלה, לחשב את צפיפות התאים הסופי אדום דם על ידי הכפלת עם 10,000 (גורם לדילול). שוטפים את תלוש כיסוי תא לספור עם מים מזוקקים ו 70% אתנול; אוויר יבש. לחלופין, לטעון 20 μL של ההשעיה על שקופית ספירת Cellometer קאמרית. הכנס את השקופית לתוך תא שקופיות Cellometer (הקורא). הפעל את התוכנה Cellometer, בחר את "תא דם אדום" אפשרות, והזן גורם לדילול של 10,000. הקלט את צפיפות RBC.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה