פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

סיכום

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי של Plasmodium yoelii והוא החלים על טפילי מלריה אחרים מכרסמים.

תקציר

וריאציה בתגובה תרופות נגד מלריה ו pathogenicity של טפילי מלריה היא ביולוגיים והחשיבות רפואי. מיפוי הצמדה הוביל זיהוי מוצלח של גנים או לוקוסים הבסיסית תכונות שונות טפילי מלריה של מכרסמים ובני אדם ^{1-3 4-6.} טפיל המלריה Plasmodium yoelii הוא אחד מיני רבים מלריה מבודד מכרסמים אפריקאי פראי הותאם לגדול במעבדות. מין זה מתרבה רבים מן המאפיינים ביולוגית של טפילי מלריה אדם; סמנים גנטיים כגון microsatellite ו מוגבר אורך קטע פולימורפיזם (AFLP) סמנים יש גם פותחו עבור טפיל ^7-9. לכן, מחקרים גנטיים טפילי מלריה מכרסם ניתן לבצע כדי להשלים את המחקר על Plasmodium falciparum. הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקות לייצור הכלאה גנטית פ yoelii כי היו הראשונים חלוץ ידי בני הזוג. דוד Walliker, ריצ'רד קרטר, ועמיתיו באוניברסיטה של אדינבורו ^10.

חוצה גנטיים פ yoelii ושאר טפילי מלריה מכרסם נערכים על ידי הדבקה של עכברים מ.א.ס. מאסכאלאס עם inoculum המכיל gametocytes של שני שיבוטים שונים גנטית שונה פנוטיפים של עניין על ידי מתן יתושים להאכיל על עכברים נגועים 4 ימים לאחר ההדבקה. הנוכחות של gametocytes זכר ונקבה בדם העכבר הוא אישר מיקרוסקופית לפני האכלה. בתוך 48 שעות לאחר האכילה, ב midgut של היתוש, gametocytes הפלואידים להתמיין הגמטות, הזכרית והנקבית, להפרות, וליצור זיגוטה דיפלואידי (איור 1). במהלך הפיתוח של הזיגוטה לתוך ookinete, המיוזה נראה להתרחש ^11. אם הזיגוטה נגזר באמצעות הפריה הדדית בין הגמטות של שני טפילים שונים גנטית, חילופי גנטי (reassortment כרומוזומליות ו צולבות בין תורות אי - אחות chromatids של זוג כרומוזומים הומולוגיים;. איור 2) עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך רקומבינציה של החומר הגנטי בבית הומולוגיים לוקוסים. הזיגוטה עוברת כל שתי חטיבות הגרעיני רצופים, המוביל four גרעינים הפלואידים. Ookinete נוסף מתפתח oocyst. לאחר oocyst מתבגר, אלפי sporozoites (צאצאיו של הצלב) נוצרות ומשוחרר hemoceal יתושים. Sporozoites נקצרים מן בלוטות הרוק ו מוזרק לארח Murine חדש, שבו פיתוח שלב טרום האריתרוציטים ו האריתרוציטים מתרחש. צורות האריתרוציטים הם משובטים ומסווגים לגבי הדמויות להבחין בקווים ההורים לפני הצמדה מיפוי גנטי. זיהומים בקרה של שיבוטים הורים יחידים מבוצעים בצורה זהה הייצור של צלב גנטית.

פרוטוקול

טכניקות אספטי חייב להיות מיושם על כל החומרים יהיה המנוהלים על בעלי חיים כדי למנוע הכנסת מכוונת של גורמים מזהמים חיצוניים לעכברים שיכול לבלבל את תוצאות הניסוי.

1. זיהום של עכברי מעבדה עם דם בשלב טפילי מלריה

1. בטמפרטורת החדר, להפשיר שני בקבוקונים המכילים בשלב קפוא דם טפילי מלריה להיות חצו. בדוגמה זו, שני זנים טפיל המלריה מכרסם בהם נעשה שימוש הם Plasmodium yoelii yoelii ו nigeriensis Plasmodium yoelii.
2. Fit מזרק עם מחט מד 22-30 (G) להכין 400 μL של סטרילית, התרופות כיתה PBS (pH 7.4).
3. שימוש במזרק זהה, להכין 100 μL של דם נגוע מופשר, להפוך את המזרק למעלה ולמטה עד התוכן מעורבב homogenously. (אופציונאלי: פיפטה ניתן להשתמש כדי להעביר PBS ודם נגוע לתוך צינור איסוף לפני העברת לתוך מזרק להזרקה).
4. להזריק 200 μL של טפיל המכיל פתרון ישירות הצפק של עכבר. בסיום, להשליך את המזרק לפח החדים. (ראה גם חומרים משלימים לתחזוקה של עכברי מעבדה). באופן כללי, בגודל סטנדרטי של inoculum הוא בין μL 100-500, תלוי ברמות של זיהומים טפיל בחומרים קפואים המקורי.
5. להזריק את שני זנים טפיל להיות חצה לשני עכברים כל אחד. עכברים תהפוך חיובית מיקרוסקופית 3 עד 5 ימים לאחר זריקות. כאשר parasitemias להגיע בין 1-5%, המשך לשלב הבא.

2. Clone זיהום מעורב של עכברים

1. לפני זיהום שיבוט מעורבים, לאסוף דם זנב משתי התורמות עכברים נגועים עם זנים שונים של הטפיל בבדיקה מיקרוסקופית של כתמי Giemsa מוכתמת דם דקים (איור 3), למדידת צפיפות תא דם אדום (ראה חומרים משלים עבור נהלים מפורט) .
2. חישוב נפח של תמיסת מלח פיזיולוגית (1.5% w / v dihydrate trisodium ציטרט, 0.85% w / v נתרן כלורי) ודם עכבר הנדרש כדי לייצר תערובת inoculum, באמצעות parasitemia ו כדוריות דם אדומות מדידות צפיפות שהושגו קודם לכן.
3. התאם את הפתרון טפיל לריכוז סופי של 1,000,000 תאים נגועים דם אדומים לכל 100μl.
4. מערבבים את דם נגוע משני תורמים ביחס של 1:1 לקבל inoculum מעורב לשבט. כאשר שני ההורים שיבוטים שונים קצב הצמיחה, להתאים את הפרופורציות של מהיר גידול הורים לשבט איטי בצמיחה הורים 01:02 או 01:05.
5. להזריק 100 μL המדגם מעורב לתוך הצפק של עכבר כל להיות נגועים. (ראה גם צעד 3.9 כדי לקבוע את מספר העכברים להיות מוזרק)
6. באמצעות שיטה זו, להדביק שני עכברים עם כל הזנים ההורים יחיד. יחיד לשבט זיהומים יאפשר קביעת שידור מוצלח של שני זני ההורים.

3. יתושי

1. הכן את שלושת הכלובים המכיל 300-500 הבוגרים (זכרים ונקבות) אנופלס stephensi יתושים כל אחד, בגיל 5-7 ימים שלאחר הופעתה של גלמים. מכולות מכוסים רשת מאובטחת על ידי פלסטיק או מכסה מתכת. שני כלובים הם עבור האכלה על שיבוטים של ההורים; את הכלוב השלישי הוא הכנה של צלב גנטית.
2. החל ארבעה ימים לאחר ההדבקה מעורב המשובט, להכין Giemsa מוכתם זנב דק כתמי דם של עכברים נגועים.
3. בדוק את מריחות במיקרוסקופ על ידי הסריקה לפחות 50 שדות בהגדלה מיקרוסקופית 1000x ולקבוע אם gametocytes זכר ונקבה נוכחים.
4. Gametocytes זכר ונקבה ניכרים בשל נוכחותם של גרגרי vacuole גדול גדול (איור 3). Gametocytes זכר ונקבה יש הציטופלסמה ורוד וכחול, בהתאמה. אם gametocytes קיימים, בצע את שלב 3.6.
5. אם gametocytes נעדרים, לשמור על מעקב יומיומי עד שהם יופיעו. אם gametocytes נוכחים, להמשיך את הצעד הבא.
6. הזרק 50 μL של קוקטייל תרופות הרדמה המכיל 33 מ"ג / מ"ל ​​של קטמין ו - 3 מ"ג / מ"ל ​​של xylazine לתוך הצפק של עכבר להרדים כל עכבר נגועים (לפי 20 גרם משקל גוף העכבר). המינון הסופי של קטמין ו xylazine הוא 82.5 ו - 7.5 מ"ג / ק"ג, בהתאמה.
7. המקום העכברים עם הפנים כלפי מטה על החלק העליון של כלוב ובו יתושים בוגרים אנופלס stephensi כי כבר מורעבים אספקת סוכר במשך 24 שעות ולאפשר היתושים להאכיל במשך 30 דקות ללא הפרעה.
8. שמירה על היתושים insectary בתנאים סטנדרטיים (חום נשמר בין 24-26 מעלות צלזיוס; גם לראות שיטות משלים לצורך תחזוקה של המעבדה יתושים).
9. השתמש באחת עכבר נגוע לכל 50-100 יתושים ממין נקבה. להרדים את העכברים מיד נקע בצוואר הרחם לאחר האכלה בזמן העכברים הם עדיין תחת הרדמה.

4. יתוש הביתור MidgUTS ו שביצים ספירת

1. תשעה ימים לאחר ההאכלה, היתושים תיבחן עבור שביצים ב midgut של חרקים. הנוכחות של שביצים ב היתושים הניזונים יחיד לשבט עכברים נגועים מצביעה על כך gametocytes של שני זני ההורים הם זיהומיות.
2. כדי לנתח midgut יתושים, השתמש aspirator קשור מיכל קטן לאיסוף 5-10 יתושים נגועים מהכלוב.
3. באמצעות גז CO _2, להרדים היתושים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי מזכוכית על הקרח. הפרד וזורקים יתושים ממין זכר. אנטנות של הזכרים באופן ניכר bushier לעומת הנקבות.
4. מילוי שני מזרקים עם PBS ולהתאים אותם עם מד 26 סנטימטר (G ^½) מחטים. על הפקדה של 100 μL PBS מתוך מזרק לשקופית זכוכית.
5. העברת 5-10 יתושים נקבה הרדים על ירידה של PBS והמקום להחליק על מיקרוסקופ לנתח.
6. שימוש במחטים אותו, להסיר את הכנפיים של כל יתוש והרגליים, ולאחר מכן, מחזיק את הבטן חרקים בבית החזה האחורי, למשוך את הגוף בנפרד עד midgut, גוף לבן דמויי כיס, הוא שוחרר. לנתק את midgut וזורקים את שאר הגוף.
7. הוסף PBS יותר על midgut אם השקופיות יבשים. Midgut יהיה מנוון אם לתת יבשים. מניחים פיסת לכסות על midguts.
8. בדוק את midguts במיקרוסקופ אור בהגדלה 100x. לספור את המספרים של כל שביצים ב midgut (איור 3). שביצים ניכרים בעובי קיר מבנים עגולים הנמצאים על פני השטח החיצוני של midguts.
9. בסיום, להיפטר מזרקים, מחטים, והחלק לפח החדים.
10. אם שביצים נעדרים midguts, להאכיל יתושים עם עכברים נגועים עם מספר גבוה יותר של gametocytes ולתת זמן האכלה יותר. טמפרטורה היא קריטית בשלב זה. ודא את הטמפרטורה מוגדר 24-26 ° C.

5. איסוף Sporozoites מ יתושים על ידי צנטריפוגה

1. הכן צינורות אוסף sporozoite כדלקמן: לחתוך את המכסה של צינור 0.5-מ"ל נקי צנטריפוגות ולהכות חור (קוטר 0.1-0.2 מ"מ) בחלקו התחתון של הצינור באמצעות flamed 19 G מחט.
2. ממלאים 1 / 3 של הצינור עם צמר זכוכית. הכנס את הצינור לתוך צינור מסנן 1.5-מ"ל אוסף (אחד שפופרת מספיקה sporozoites הקציר מ ~ 100 יתושים)
3. על האכלה 17 יום הודעה, לאסוף יתושים (שלב 4) מן הכלובים לתוך מיכל קטן באמצעות aspirator.
4. השתמש גז CO ₂ להרדים יתושים.
5. הפרד את הנקבות מן יתושים ממין זכר. העברת היתושים נקבה הרדים מהקופסה כדי בצלחת פטרי מזכוכית על הקרח.
6. הכן שני מזרקים עם 26 מחטים G ^½ מלא PBS. על הפקדה של 100 μL PBS מתוך מזרק לשקופית זכוכית.
7. העברת היתושים לשקופית מיקרוסקופ. הסר את הראש של היתושים, כנפיים, רגליים, בטן תחת מיקרוסקופ לנתח.
8. באמצעות קנס שקצהו מלקחיים העברת thoraxes לתוך 0.5 מ"ל PBS ב homogenizer 1.5-מ"ל (מכתש ועלי). חנות thoraxes על הקרח (sporozoite נשאר זיהומיות עבור 2-3 שעות).
9. Homogenize thoraxes על הקרח כדי לשחרר sporozoites של בלוטות הרוק (ראה איור 3), ולהעביר את lysates (homogenates) לתוך הצינור מלא צמר זכוכית (שלב 5.1-5.2) באמצעות פיפטה מזכוכית.
10. צנטריפוגה במשך 10 עד 20 שניות ב 1000 סל"ד בטמפרטורת החדר.
11. אסוף את flow-through (ההשעיה sporozoite מטוהרים) באמצעות מזרק עם מחט G 22-30. (אופציונאלי: ירידה 10-50 μL של זרימה דרך בשקופית מיקרוסקופיים, במקום לכסות להחליק לדמיין את sporozoites לחיות תחת מיקרוסקופ אור רגיל, הגדלה 400X, ראה גם איור 3)
12. הזרק מ"ל ip של 0.1-0.5 ההשעיה sporozoite לעכברים (עד 200,000 טפילים ניתן לקצור מן יתוש אחד; לראות נ"צ 12). במקרה המוצלח, החיה יהיה להידבק 72 שעות לאחר ההזרקה.

6. שיבוט צאצאיהם באמצעות דילול מוגבל

1. שבעים ושתיים שעות לאחר זריקות sporozoite, לאסוף דם זנב משתי התורמות עכברים נגועים עם זנים שונים של הטפיל בבדיקה מיקרוסקופית לאחר צביעה Giemsa של כתמי דם דקים למדידת צפיפות תא דם אדום (ראה חומרים משלים עבור נהלים מפורט).
2. פיק עכבר הצגת parasitemia 0.1-1% ותאי דם אדומים נגועים אשר מכילים טפילים חד בעיקר תורם של תהליך השכפול. חזור על שלב 6.1 הימים הבאים אם עכברים הם מיקרוסקופית שלילית. אם בעלי החיים אינם נגועים בתוך 14 ימים, חזור על שלב 2 עד 5 לקבוע את הנוכחות של sporozoites בשלב 5.11).
3. לדלל את הדם זנב שנקטפו בפתרון 01:01 הקר של פתרון Ringer עגל בסרום של היונקים (2.7 mM אשלגן כלוריד, קלציום כלוריד 1.8 מ"מ, 154 נתרן כלוריד mM) כדי להשיג קוןcentration של 0.6 לתא דם נגוע 1 אדום לכל μL 100, ולאחסן את inoculum על הקרח. באופן זה, רוב עכבר הפרט צריך לקבל אחד או אפס טפילים.
4. להזריק לווריד 100 μL של דם נגוע בדילול מלא בכל אחד של 50 עד 100 עכברים.
5. חמישה עד שבעה ימים לאחר מכן, המסך עכברים נוכחות של טפילים על ידי בדיקת דם בשלב Giemsa מוכתם כתמי דם דק. בניסוי מוצלח, 20-50% של העכברים להידבק ו יראה parasitemia של 0.1-5.0% על זיהום 8 יום פוסט.

7. אפיון צאצאיהם באמצעות סמנים גנטיים

1. איסוף 20-40 μL דם זנב עכבר בצינור 1.5-מ"ל microcentrifuge המכיל 0.2 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית צונן ציטרט, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 3000 סל"ד בטמפרטורת החדר כדי גלולה בתאי הדם. תמצית ה-DNA באופן מיידי או לשמור את גלולה ב -80 ° C.
2. הכן את ה-DNA הטפיל באמצעות מיצוי כל השיטות הסטנדרטיות DNA. עבור בידוד המהירה של ה-DNA, יש להשתמש גבוהה טהור הכנה PCR תבנית Kit (Roche Applied Bioscience).
3. הצאצאים רקומביננטי מזוהים לאחר genotyping באמצעות microsatellite (MS) או פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP) על כרומוזומים שונים שיכולים להבחין בין שני זני ההורים הצלב גנטית. שיטה פשוטה באמצעות primers ניאון שכותרתו יחיד עבור MS genotyping של פ yoelii ניתן להשתמש (ראו נ"צ 8,9).

8. Cryopreservation של דם בשלב טפילי מלריה

1. איסוף 0.5-1 מ"ל של דם נגוע לנקב לב מהעכבר הרדים עם parasitemia של 5-20% ב 5-10 מ"ל מקורר תמיסת מלח פיזיולוגית.
2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 סל"ד בטמפרטורת החדר. בטל supernatant.
3. הוסף ירידה מבחינת נפח 2x של פתרון 57 Glycerolyte (Fenwal Laboratories) על גבי כדוריות הדם ומערבבים היטב.
4. מעבירים את ההשעיה על cryotubes (0.2-0.5 מ"ל לכל צינור).
5. חנות דם cryopreserved ב -80 ° C (עד חודש 1) או חנקן נוזלי.

9. נציג תוצאות:

בניסוי מוצלח, 5-10% של קווי משובטים יהיו צאצאים רקומביננטי עצמאית.

באיור 1. ייצוג סכמטי של מחזור החיים ואירועים רקומבינציה גנטית במהלך לחצות גנטי. אירועי רקומבינציה גנטית להתרחש בשלב מוקדם של התפתחות היתוש. לאחר הפריה של גמטות "הפלואידים" זכר ונקבה של רקע גנטי שונה midgut של היתוש, zygotes "דיפלואידי" נוצרים. הזיגוטה מהווה שלב דיפלואידי רק מחזור החיים של טפיל; המיוזה כדלקמן בתוך 12 שעות של הפריה, וכל בשלבים הבאים של היתוש ויונקים להישאר הפלואידים. Zygotes כתוצאה להתפתח ookinetes ו שביצים. צמיחה וחלוקת mitotic של oocyst כל מייצרת אלפי sporozoites, אשר מתפזרות hemoceal "יתושים. אלה sporozoites כי להגר בלוטות הרוק נמצאים בעמדה להיות משודר לארח יונקים, שם התפתחות של הכבד, אדום דם תאים בשלבים מתרחשת. במהלך המחזורים תא דם אדום, טפילים מסוימים יכולים להתמיין gametocytes זכר ונקבה בוגרת. מחזור החיים של הטפיל יושלם כאשר אלה gametocytes נתפסות על ידי שידור אחר יתושים, להנציח.

איור 2. ירושה של גנים גרעיניים טפילי מלריה וייצור של הצאצאים רקומביננטי. רקומבינציה גנטית ניתן להפיק באמצעות reassortment כרומוזומליות או על ידי אירועים מוצלב. הצאצאים הומוזיגוטים המיוצר על ידי selfing בין הגמטות של ההורים לשבט אותו 1 או 2 (A ו-D), בהתאמה. ב) הצאצאים הטרוזיגוטיים המיוצר על ידי הפריה הדדית בין הגמטות של שני ההורים שיבוטים שונים, גרעינים רקומביננטי (אליפסות כחול) שהוא נוצר על ידי reassortment כרומוזומליות בלבד. ג) הצאצאים הטרוזיגוטיים המופק הפריה הדדית בין הגמטות של שני ההורים שיבוטים שונים, גרעינים רקומביננטי (אליפסות אדום) מתהווה על ידי crossovers בין אי - אחות chromatids של כרומוזומים הומולוגיים.

איור 3. מורפולוגיה של טפיל המלריה מכרסם Plasmodium yoelii. א) שלב טבעת, B) trophozoite, C) schizont, ד) merozoites, E) gametocyte זכר בוגר, F) gametocyte זכר בוגר, G) gametocyte נקבה בוגרת, H) gametocyte נקבה בוגרת, אני) midgut עם שביצים על מוצב ביום 10 האכלה (שביצים בוגרת מסומנים על ידי חצים; 200x הגדלה), J) בלוטות הרוק יתוש (בהגדלה 100x), K) sporozoites (400x הגדלה).

דיון

אנו מדגימים את הטכניקות לייצור צלב גנטי המלריה Plasmodium מכרסם yoelii, שגם הוא החלים על ייצור של צלבים גנטי malarias מכרסמים אחרים. זיהומים של עכברים עם שיבוטים אחד ההורים מבוצעים בדרך כלל כדי לקבוע שידור מוצלח של טפילים ההורים על מנת להבטיח כי ההורים הם המוסמכים בייצור הגמטות פונקציונלי לפני ביצוע צלב.

שידור מוצלח באמצעות יתוש מושפע מגורמים רבים, כולל טמפרטורה של insectary, מינים של מלריה טפיל...

חומרים

משלים חומרים:

• תחזוקה של עכברי מעבדה
• תחזוקה של המעבדה יתושים
• בבדיקה מיקרוסקופית של כתמי דם דק מוכתמים Giemsa כתם
• מדידת צפיפות תא דם אדום

תחזוקה של עכברי מעבדה

נקבות של זן עכבר מעבדה מולדת BALB / c, בגילאי 5 עד 8 שבועות הישן, הם השתמשו במחקר. עכברים הם שוכנו כלוב סטנדרטי פוליקרבונט מוצק תחתית עם מכסה מתכת בר, מצויד במזין ובקבוק מים. עכברים נשמרים בטמפרטורה קבועה (25 ± 1 ° C) על שעה 12:12 אור: מחזור כהה. עכברים מותר להאכיל על 2018S הרלן Teklad גלובל 19% חלבון בתזונה extruded מכרסם (sterilizable; הארלן מ-Teklad) וסיפקה עם שתיית מים כרצונך acidified המודעה. ניסויים בבעלי חיים מתבצעים בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש במכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות תחת פרוטוקול LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד).

תחזוקה של המעבדה יתושים

יתושים הם מהמושבה מעבדה-bred של אנופלס stephensi. המבוגרים נשמרים בכלובים ניילון המשיך בחדר טמפרטורה ולחות מבוקרת (23-25 ​​מעלות צלזיוס למשך Plasmodium Plasmodium chabaudi yoelii ו, ו 19-21 ° C עבור Plasmodium berghei; 80-95 לחות%; ב 12:12 שעות אור: מחזור כהה). יתושים בוגרים ניזונים עם גלוקוז 10% ו 2.00% para-aminobenzoic חומצה (PABA) פתרון בתוספת מים. כדי להשיג איכות גבוהה מבוגרים, 500 הזחלים גדלים בתנאי צפיפות נמוכה ב L 1 של מים מזוקקים בצלחת ³ 1000 ס"מ לפתוח מסופק עם כ 1 מ"ג של סודיום ביקרבונט. לאחר הבקיעה, הזחלים מקבלים tetramin אבקה (PETCO) עד שהם להתפתח בשלב גולם והם הועברו הכלובים יתושים בוגרים עבור המתעוררים.

בבדיקה מיקרוסקופית של כתמי דם דק מוכתמים Giemsa כתם

מספריים לגזור את השימוש לנקות את קצה (1.0 מ"מ) של הזנב של העכבר נגועים. מקום אחד ירידה (0.5-1.0 μL) של דם זנב לשקופית טיפוס נקי. עכבר יהיה לעצור את הדימום בתוך 1-2 דקות. המקום שקופיות מפזר נקי על גבי טיפת דם, שמירה על אותה משפחה 45 ° זווית להחליק את הדגימה, ומאפשרים לדם לספוג לרוחב כל מפזר. החזק את השקופית הדגימה לדחוף קדימה את השקופית מפזר במהירות בצורה חלקה לייצר כתם דק. תנו את הסרט דם יבש, ואז לטבול את השקופיות מתנול מוחלט. אפשר להחליק לייבוש באוויר פעם נוספת לפני מכסה אותו עם כתם Giemsa (10% Giemsa צבע במים מזוקקים). לאחר דוגרים הסרטים דם דק 10-15 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף היטב את השקופיות עם מי ברז ולתת לו להתייבש באוויר. בדוק את מספר נגועים בתאי דם אדומים (iRBC; ראה איור 3 עבור המורפולוגיה של RBC נגוע) תחת מיקרוסקופ אור עם שמן טבילה בהגדלה 1000x (עם עדשה אובייקטיבי 100x) ולחשב parasitemia (מספר iRBC ל -100 RBC ספרתי). זנים שונים של טפילי מלריה להשתנות בקצב הצמיחה pathogenicity. מעקב אחר שלב parasitaemias הדם יכול להתבצע 24 שעות לאחר זריקות, תלוי במינון של השלב טפילים בדם מלריה. למשל, בעכברים יהיה מיקרוסקופית חיובית 24 שעות כאשר הוא מוזרק עם 10 ⁷ נגוע RBC intraperitoneally או 10 ⁶ RBC נגוע לווריד.

מדידת צפיפות תא דם אדום

כמו רמות parasitaemias, תא דם אדום (RBC) צפיפות עכברים נגועים משתנה לאורך הקורס של זיהום. צפיפות RBC יש למדוד בתוך 1-2 שעות לפני תחילת הזיהום יחיד ו מעורב לשבט הניסויים השיבוט. קיימות שתי שיטות למדידת צפיפות RBC: ספירה ידנית באמצעות Neubauer hemocytometer ו ספירה אוטומטית באמצעות Cellometer (Nexcelom Bioscience). בשתי השיטות, לסגת 1 μL דם העכבר הזנב באמצעות זכוכית נימי (VWR) ו לדלל ב 10 מ"ל של PBS ומערבבים היטב. כדי להשתמש hemocytometer Neubauer, עומס 20 μL של ההשעיה על hemacytometer. מניחים את hemacytometer על מיקרוסקופ אור עם עדשה 10x אובייקטיבי. Hemacytometer מכיל רשת מחולק 9 ריבועים גדולים, 4 ריבועים גדולים בפינת מחולקים נוספת לתוך 16 ריבועים קטנים. ספור את המספר הכולל של תאים בכל אחת 16 ריבועים קטנים של ארבעה ריבועים בפינה. כדי למנוע הטיה או לספור ספירת התאים חפיפה קו רשת, לספור תא כמו "ב" אם זה חופף את הקווים העליון או ימין "החוצה" אם זה חופף את השורות למטה או שמאלה. אומדן מספר התאים לכל ריבוע אחד קטן ולחלק ידי 0.00625 (נפח של ריבוע אחד קטן הוא 6.25 NL). זה מניב את מספר התאים לכל microliter (&mu, L). מתוך נתונים אלה, לחשב את צפיפות התאים הסופי אדום דם על ידי הכפלת עם 10,000 (גורם לדילול). שוטפים את תלוש כיסוי תא לספור עם מים מזוקקים ו 70% אתנול; אוויר יבש. לחלופין, לטעון 20 μL של ההשעיה על שקופית ספירת Cellometer קאמרית. הכנס את השקופית לתוך תא שקופיות Cellometer (הקורא). הפעל את התוכנה Cellometer, בחר את "תא דם אדום" אפשרות, והזן גורם לדילול של 10,000. הקלט את צפיפות RBC.