מאמר שיטה

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

DOI:

10.3791/2387

⸱

4 בדצמבר 2010

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם ניאון באתרו הכלאה על מנת למדוד במדויק את הקינטיקה הייצוא הגרעיני של mRNA של יונקים תאים סומטיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב אאוקריוטים, RNA שליח (mRNA) הוא עיבד בגרעין והוא חייב להיות מיוצא לתוך הציטופלסמה לגשת מכונות תרגום. למרות הייצוא הגרעיני של ה-mRNA, נחקרה בהרחבה ב ביציות Xenopus 1 ואורגניזמים ממושמע גנטית כגון שמרים 2 וקו נגזר תסיסנית תא S2 3, מחקרים מעטים נערכו בתאי יונקים. יתר על קינטיקה של הייצוא ב mRNA יונקים תאים סומטיים יכול רק להסיק 4,5 בעקיפין. על מנת למדוד את הקינטיקה הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים תרבות רקמות, פיתחנו assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם ניאון הכלאה באתרו (FISH). מבחני אלה היו בשימוש על מנת להוכיח כי בתאי יונקים, רוב mRNAs מיוצאים באופן שחבור תלוי 6,7, או באופן ספציפי הדורש רצפי הרנ"א כגון האזור אות רצף קידוד (SSCR) 6. ב assay זה, התאים microinjected עם או במבחנה mRNA מסונתז או DNA פלסמיד המכיל את הגן של עניין. התאים microinjected מודגרת נקודות זמן שונות קבוע אז הלוקליזציה המשנה הסלולר של RNA הוא הוערכה באמצעות FISH. בניגוד transfection, שם השעתוק מתרחשת מספר שעות לאחר תוספת של חומצות גרעין, microinjection של ה-DNA או mRNA מאפשר ביטוי מהיר ומאפשר הדור של נתונים קינטית מדויקת.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיימות שתי שיטות microinjection מבוססי כי ניתן להשתמש כדי למדוד את הקינטיקה של יצוא mRNA בתאי יונקים, הזרקת mRNA מסונתז במבחנה, או פלסמיד דנ"א, אשר עיבד in vivo לתוך ה-mRNA. כל טכניקה יש יתרונות וחסרונות. כאן אנו מתארים שני טכניקות לדון בהבדלים בין שתי הגישות.

1. הכנת חומרים להזרקה

  1. ב-mRNA במבחנה עיבד
    1. ה-mRNA הוא עיבד משני פלסמידים או מוצרים PCR המכילים את הגן של עניין ולצדו הזרם על ידי האמרגן RNA פולימראז המתאימה (כלומר T7 או SP6 היזמים). תמלול מתבצע במבחנה בעזרת האנזים המתאים (או T7-RNA פולימראז SP6, Invitrogen) עם נוקליאוטידים מתאימים אנלוגי כובע עודף.
    2. התמלילים הם polyadenylated במבחנה באמצעות פולי-A-פולימראז (Invitrogen) ו-ATP על פי פרוטוקולים של היצרן.
    3. ה-mRNA הוא אז מטוהרים באמצעות עמודות משני Invitrogen או Qiagen.
    4. MRNA eluted הם זירז אז על ידי הוספת נפח 1/20th 3M אשלגן אצטט 2 כרכים של אתנול 100% ב -20 ° C למשך שעה אחת ואחריו צנטריפוגה ב 13000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אם נוזל עודף קיים, גלולה ניתן לכבס עם אתנול קרים 70%.
    5. MRNA גלולה המתקבלת היא אוויר יבש solubilised אז חיץ הזרקה (140mM KCl ו HEPES 10mm, pH 7.4). שים לב שכל אתנול מזהמים עלולים להיות רעילים לתא microinjected. MRNA solubilized יכולים להישמר ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
    6. עבור microinjection, ה-mRNA הוא מדולל ל 200μg/ml במאגר הזרקת מעורבב עם אורגון גרין 488 (OG), מצומדות 70kDa dextran (1mg/ml; Invitrogen). מאז OG-מצומדות dextran גדול מדי מפוזר על פני הנקבובית גרעיני, תאפשר אחד לא רק כדי לזהות תאים מוזרקים, אלא גם לעזור לקבוע כמה נוזלים היה מוזרק לתוך הגרעין וכמה דלף לתוך הציטופלסמה ( ראו 4.1.2). לחלופין, פלורסנט בכלל, משקל מולקולרי גבוה המולקולה אינה מסוגלת לעבור את נקבוביות הגרעין עשוי לשמש.
    7. דוגמאות הן centrifuged ב g 13,000 ב -4 מעלות צלזיוס לפחות 20min לפני טעינת את המחט על מנת ענין חלקיקי גלולה כי פוטנציאלי עלול להכשיל את קצה המחט.
  2. פלסמיד דנ"א
    1. ה-DNA פלסמיד המכיל את הגן של עניין ניתן להכין באמצעות תקן טיהור ערכות דנ"א Qiagen. ההכנות DNA בדרך כלל גדולים יותר נוטים להיות באיכות גבוהה יותר ובכך מתועתקים ביעילות רבה יותר לאחר ההזרקה.
    2. פלסמיד דנ"א הוא מדולל ל 50 200μg/ml במאגר זריקה המכילה OG-מצומדות 70 kDa dextran (1mg/ml).
    3. לפני טעינת את המחט, הנוזל הוא הזרקה centrifuged ב g 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 20min.
  3. מחטים עבור microinjection
    1. מחטים מיוצרים מ 1.0mm צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי (פריט # 1B100F-3; העולם Precision מכשירים בע"מ) באמצעות סאטר p97 Flaming / בראון micropipette פולר עם נימה 2.5mm.
    2. המחטים הזרקת נוצרות באמצעות תוכנית השלב השלישי מושך באמצעות תיבת 2.5x4.5 מ"מ נימה (פריט # FB245B, סאטר Instrument ושות'). הפרמטרים בתוכנית השתמשו בניסוי זה מפורטים להלן, אך הן צריכות להיות מותאמות כל נימה.
      שלב # חום משוך מהירות זמן לחץ
      1 740 100 8 250 500
      2 740 100 8 250 500
      3 740 100 10 250 500

      (טמפרטורת Ramp = 740)
  4. תא הכנה
    1. בדרך כלל כל שורת תאים יונקים ניתן microinjected, אולם סוגי תאים, כי הם התפשטו גם נוטים להיות נוחה יותר לקבל זריקה. הבחירה של קו התא עשוי גם תלוי בגורמים אחרים. לדוגמה, mRNAs כי קוד חלבונים המופרשים ממוקדות פני השטח של reticulum endoplasmic וזה הרבה יותר גלוי COS-7 תאים לעומת fibroblasts NIH 3T3 6 (להשוות את הלוקליזציה של t-mRNA FTZ-Δi במספרים 3 ו 4).
    2. תאים צריכים להיות seeded על חומצה שטף coverslips מרובע (25x25mm) ב petridishes 30mm לפחות 24 שעות לפני microinjection. ב שורות תאים מסוימים, להפיץ יכול להיות מגורה על ידי תאים ציפוי על coverslips מצופה פיברונקטין 6,8. באופן אידיאלי monolayer הסלולר צריך להיות בערך 70-90% ומחוברות בזמן ההזרקה.
    3. כדי לאפשר זיהוי קל של תאים מוזרק, monolayer התא נפצע לפני ההזרקה באמצעות קצה 200μl פיפטה פלסטיק. בדרך פצע צלב (איור 1) הוא חרוט על coverslip והתאים נותרים להתאושש במשך לפחות 15 דקות לפני הזריקה של תרביות רקמה חממה.
    4. במהלך microinjection, תרבות התקשורת רקמות לאט מאבד CO 2 דיפוזיה וכתוצאה מכך הופך אלקלי. כדי לסייע לשמור על pH נייטרלי במהלך ההזרקה, התקשורת ניתן להוסיף HEPES 10mm pH 7.4. חיץ נוסף ניתן להוסיף את התקשורת יום לפני microinjection.
  5. מיקרוסקופ ו Micromanipulator
    1. תאים הם microinjected באמצעות מיקרוסקופ הפוכה כי היא מבודדת על שולחן האוויר כדי למזער את תנודות שניתן מפריעה לתהליך microinjection. המיקרוסקופ מצויד שתי מטרות: חתיכת 10x יבש, המשמש למיקום התאים את המחט, ועל יבש 40X מרחק תוספת זמן עבודה שלב אובייקטיבי, אשר משמש את התמונה תהליך microinjection.
    2. סטיות אופטיות נגרמת על ידי תאים צפייה לרוחב coverslip ו petridish ניתן לבטל אם אובייקטיבית יש צווארון תיקון. הבטחה כי brightfield של מיקרוסקופ מיושר כראוי קוהלר תאורה 9, גם יעזור הנכון עבור סטיות שנגרמו על ידי אור להיות מפוזרים על ידי מחט ההזרקה (ראה 2.2.4).
    3. המחט נשלטת על ידי מכשיר בשלושה צירים תלוי ג'ויסטיק המיקרומניפולציה (NT-88-V3MSH, Narishige). מניפולטור גס מאובטח על העמוד האחורי של מיקרוסקופ כדי לאפשר את המחט יועלה בקלות והוריד לתוך המנה תוך שמירה על המיקום המקורי.
    4. המחט מאובטח כדי שרביט כי הוא הידק את מניפולטור גס. צינור המחבר את השרביט אל מזרק זכוכית 5cc (פריט # 512311; בקטון דיקינסון), אשר יוצרת את הלחץ הדרוש כדי להוציא הזרקת נוזל מקצה המחט microinjection. כדי לשלוט ברמת הלחץ, קנה מזרק בוכנה מוחזקים במצב ידי הרגולטור מזרק אשר מורכב משני פקקים, מהדק צינור (זמין בכל חנות חומרה) ושני מלחצי מתכת (איור 2). על מנת להבטיח כי המזרק שומרת בלחץ גבוה, גריז ואקום (Dow Corning) על הבוכנה את המזרק.
  6. בדיקה הכלאה פלורסנט
    1. הרצף הראשוני של חומצת גרעין מוזרק מקופלת באמצעות RNA מבנה משני חיזוי תוכנה, כגון RNAstructure 4.6 10.
    2. קפלי mRNA מוערכים חזותית לזיהוי אזור של כ - 50 נוקלאוטידים, אשר נוטה להיות חופשי של מבנים משניים עם טמפרטורות התכה גבוהה, כגון גדילי כפול ארוך.
    3. משלימים הפוכה של האזור הזה הוא מסונתז עם fluorophore Alexa546 מצורף לסוף '5 של בדיקה (אלה ניתן לרכוש טכנולוגיות משולבות DNA).
    4. בדיקה הוא מדולל במים לריכוז של 100μM ו מאוחסן -80 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שנים.

2. Intranuclear Microinjection

  1. טעינת הזרקת נוזל על המיקרוסקופ microinjection
    1. 1μl כ הזרקה של נוזל שאוב הדנ"א centrifuged או מדגם ה-mRNA באמצעותGELoader טיפים (פריט # 022351656; Epindorff). צריך להיות נוזלי aspirated מהחלק העליון של המדגם, כדי למנוע שיבוש גלולה המכילה חומר חלקיקי זה עלול להדביק את המחט.
    2. טיפ של פיפטה מוכנס לתוך האחורי של המחט, את הנוזל נפלט. נוזלי יצויר אל קצה המחט על ידי פעולה נימי ו המניסקוס ליד קצה צריך להיות גלוי בתוך 5-30sec.
    3. המחט מלאות נוזל מוכנס לתוך שרביט, אשר הידק אז micromanipulator בזווית של ° 45.
    4. המחט היא דמיינו במטרה 10x ו ממוקם במרכז המטוס צפייה ליד המטוס מוקד באמצעות ידיות micromanipulator גס. המחט עולה אז כמה מילימטרים כדי למנוע את נפגע צעדים מאוחר יותר (2.2.2) ולאחר מכן העמוד האחורי מיקרוסקופ הוא דחף בחזרה.
    5. הלחץ גדל מדכא את הבוכנה 0.5-2cc.
  2. Microinjection
    1. Petridish המכיל כיסוי להחליק עם monolayer פצוע מושם על השלב הצפייה.
    2. העמוד האחורי מיקרוסקופ נמשך קדימה בתנוחה זקופה, בגרימת הקבל להיות מיושר ואת המחט כדי להזין את הנוזל. זה צריך להיעשות בזהירות כדי למנוע את המחט לפרוץ אל coverslip (ראה 2.1.4).
    3. שימוש המטרה 10x, במרכז הפצע לחצות מזוהה המחט ממוקם מעל התאים להיות מוזרק.
    4. ההגדלה היא עלתה מעבר ליעד 40X ואת המחט הוריד מרוכז באמצעות כפתורים התאמה קנס על הג'ויסטיק. אם התמונה היא מחוץ לפוקוס, יש להבטיח כי לאור המקרה מיושר כראוי (כלומר Kölher תאורה 9) באמצעות עדשה ברטרנד (ראה 1.5.2).
    5. הזרקת צריך להתחיל באחת מפינות לחצות את הפצע המשיך לאורך קצה אחד לזיהוי קל של תאים שהוחדר במהלך להדמיה (ראה איור 1).
    6. המחט היא הורידה ליצור קשר עם הגרעין. אפשר בקלות לומר כי תא כבר מוזרק על ידי שינוי בולטת בהירות שלב המלווה בהזרקה.
    7. אם הנוזל ממלא את כל התא זה עשוי להצביע על כך הלחץ הוא גבוה מדי, צריך להיות הוריד.
    8. אם לא חל שינוי בהירות שלב מזוהה, זה עשוי להצביע על כך גם את הלחץ microinjection אינו חזק מספיק כדי לחדור קרום התא, או את קצה המחט סתומים. זה עשוי להיות תוצאה של מספר נושאים ביניהם: הלחץ לא מספיק, פגמים המחט, סתימה של קצה מחט עם חומר חלקיקי קטן. מאז מטעינת מחט לתוך micromanipulator הוא זמן רב, מאז המצע זריקה הוא לעתים קרובות בעל ערך רב, חשוב על מנת למקסם את אחוז מחטים כי ניתן להשתמש ביעילות זריקות. להלן מדריך צעד אחר צעד על מנת לנסות לבטל את החסימה קצה מחט סתומים. לאחר כל שלב, יש לנסות להזריק 2-3cells להעריך אם החסימה הוסרה:
      פעולה מטרה המטרה
      1 התאם להתמקד כדי לראות את אורך של קצה המחט. כדי לקבוע אם יש פגם ברור של המחט או אם יש חתיכה גדולה של חלקיקי חוסמת את קצה.
      2 הניחו את קצה מחט ליד פיסת צף של חלקיקי בצלחת. אם הנוזל הוא היציאה טיפ זה צריך להתסיס את החלקיקים מבלי שזה יבוא במגע ישיר עם המחט.
      3 לוחץ על המתג עד הסוף של המזרק זו עלייה זמנית בלחץ צריך לנקות כל חסימה בקצה. לאחר שחרור הבוכנה, זה אמור לעלות על מעצמו, ואם לא, זה אמצעי הלחץ לא להיות בנוי בתוך המזרק ואתה צריך להדק את הקשרים ו / או להוסיף שומן ואקום נוספים.
      4 תרים את המחט של מד תאIA הכוח של הציור מחט מתוך התקשורת מימית יכול לעזור לסלק מכשולים על קצה המחט.
      5 הסר את הבוכנה של המזרק לחלוטין והכנס אותו. גידול זה נוסף בלחץ ייתכן שיהיה צורך לנקות את קצה המחט.
      6 גרדו את קצה המחט על חלק נקי של coverslip עוד זה מסעיר חלקיקים בתוך המחט ועוזר למקם אותה מחדש כדי להקל על חסימה בקצה. Stronger מגרד עשוי שבב מקצה לקצה, המאפשר חסימה כדי לצאת את המחט.
      7 טען מחט חדשה


      בעיה נוספת נפוצה היא אובדן הדרגתי של לחץ בתוך המחט, הדורשים פיצויים תכופים על ידי עוד מדכא על הבוכנה של המזרק. לעתים קרובות, הוספת שומן ואקום נוספים הבוכנה את המזרק יכול לעזור לשמור על לחץ אחיד יותר. אולם הבעיה עלולה להיות עקב דליפות הקשרים בין מזרק צינור, הצינור ואת שרביט, או את השרביט ואת המחט. דליפות אוויר רוב יכול להיות אטום באמצעות Parafilm (פישר) או שומן במידת הצורך, אם כי הדלפות בין שרביט ואת המחט ניתן לתיקון רק על ידי שינוי אטם גומי שרביט.
    9. תאים בשולי פצע הם microinjected בשולי הפצע לתקופה קצובה (10-15min). בעזרת תרגול של כמה מאות תאים ניתן להזריק בזמן ההפסקה הזאת.
    10. לאחר microinjection, התאים מודגרת על 37 מעלות צלזיוס תרבות רקמות חממה בכמות הרצויה של זמן לפני קיבעון. אם הזרקת DNA, שעתוק הוא הופסק לאחר 20min ידי טיפול בתאי עם α-amanitin (1μg/ml; סיגמא אולדריץ ') מומס התקשורת הצמיחה. ריכוז זה למעשה מעכב שעתוק של פלסמיד microinjected (איור 3).
    11. מחט אחת ניתן לעשות שימוש חוזר להזריק coverslips מרובים, למרות המחט צריך להיות מוחלף כאשר אחד השינויים סוג של DNA או RNA כי הוא microinjected. לאחר מחט יוסר שרביט הוא צריך להיות מסולק ולא לעשות בה שימוש חוזר.
    12. תאים מתים או צף מדי פעם מקל אל קצה המחט יכול להפריע microinjection. כדי להסיר הפסולת מן המחט, להעלות את המחט של הנוזל על ידי להדוף את העמוד ואז לאט לאט מחדש את המחט בחזרה לתוך הנוזל על ידי מתקנים את העמוד למצב זקוף.
    13. כדי לקבל מדידה מדויקת של מדידת הייצוא הגרעיני mRNA קינטיקה, דגימות נפרדות צריך להיות קבוע 0min, 15 דקות, 30 דקות, ו 60min 120min שלאחר RNA microinjection, או לאחר טיפול α-amanitin.

3. קיבוע נייד ו מכתים

  1. קיבוע נייד ו Permeabilization
    1. בזמן המתאים, התקשורת הצמיחה aspirated והתאים נשטפים פעמיים עם 2 מ"ל PBS פתרון (137mM NaCl, KCl 2.7mM, 10mm Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7.4). חשוב לשמור על לחות coverslips על ידי צמצום הזמן הם אינם שקועים בנוזל.
    2. התאים קבוע על ידי הוספת 2ml paraformaldehyde של 4% (מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים) ב-PBS במשך לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הדגימות קבוע נשטפים פעמיים עם פתרון PBS.
    4. התאים permeabilized עם 2ml של 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הדגימות נשטפים פעמיים עם פתרון PBS.
  2. FISH מכתים
    1. הבא דוגמאות את הצורך להיות מוכנים הכלאה. התאים נשטפים פעמיים עם פתרון SSC 1x (NaCl 150mm, 15mm ציטרט הנתרן, pH 7.0) עם formimide 25-60%. עבור סכום של לפוראמיד, להשתמש בריכוז זהה, כי נוכח הפתרון הכלאה (ראה 3.2.3).
    2. כדי להכין את החדר מכתים, בתחתית petridish 150mm מכוסה מים וחתיכת Parafilm הוא צף על המים. המים הוא הסיר על ידי סיבוב מעל צלחת, ובכך מאפשר Parafilm לדבוק התחתון של המנה. בועות האוויר מחדש באופן ידניזז.
    3. במשך כל coverslip להיות מוכתם, טיפות 100μl הפתרון הכלאה (25-60 לפוראמיד%, 100mg/ml dextran סולפט, 1mg/ml E. coli tRNA, riboside 5mm מורכב vanadyl ב 1x SSC עם בדיקה מדולל 1:500) הם pipetted על parafilm. שים לב כי כמות לפוראמיד צריך להיות מותאם במיוחד לחקור את דג מסוים בשימוש.
    4. בעזרת מלקחיים, coverslip יוסר petridish 30mm, ולאחר מכן באמצעות Whatman מסנן נייר (VWR) את הצד האחורי (תא ללא צד) של coverslip היא חיץ יבשים עודף רשעים מן הצד הקדמי ללא ייבוש קבוע תאים. Coverslip ממוקם אז עם הפנים כלפי מטה על הפתרון FISH. זה חוזר על עצמו עבור כל coverslip.
    5. לאחר שהניח את מכסה תא מכתים בחזרה, הדגימות מודגרת עבור 5-18hrs על 37 ° C.
  3. כביסה הרכבה דוגמאות ויטראז
    1. מספר חדרי כביסה נעשים באותו אופן כמו החדר מכתים (ראה 3.2.2).
    2. במשך כל coverslip, 1 מ"ל של לשטוף חיץ (1x SCC עם לפוראמיד 25-60%) היא pipetted על parafilm של חדר הכביסה. שוב, להשתמש ריכוז זהה של לפוראמיד כי נמצא הפתרון הכלאה (ראה 3.2.3).
    3. כדי להסיר את coverslips מן החדר מכתים, 1ml של המאגר הוא לשטוף pipetted ליד coverslip. הנוזל צריך להיות נמשך מתחת מדגם ידי כל פעולה נימי.
    4. בעזרת מלקחיים, coverslips מוסרים וכל מושם על ירידה של חיץ לרחוץ מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    5. צעדים 3.3.2 על 3.3.4 חוזרים פעמיים נוספות, כך שכל coverslip נשטף סך של 3 פעמים.
    6. אם RNA הוא להיות costained עם חלבון כלשהו על ידי immunofluorescence, ראה סעיף 3.4.
    7. שקופיות נשטפים עם אתנול 70%, מיובשים עם Kimwipes. במשך כל coverslip, 10-30 μl של הרכבה פתרון עם DAPI (Fluoromount G, דרום ביוטק) הוא pipetted על השקופיות. כל שקופית יכולה להכיל שני coverslips.
    8. בעזרת מלקחיים ונייר Whatman לסנן את החלק האחורי של coverslips הוא מיובשים נוזל עודף הוא רשע את הצד הקדמי של coverslip מבלי לייבש את הדגימות. Coverslip כל מושם אז עם הפנים כלפי מטה, על ירידה של פתרון גובר.
    9. דגימות רכוב ניתן לאחסן ב 4 ° C.
  4. Immunofluorescence מכתים
    1. דוגמאות יש לרחוץ פעמיים עם PBS להסיר לפוראמיד אשר יכול להפריע מכתים נוגדן הנכון.
    2. במשך כל coverslip, 50μl של פתרון נוגדן ראשוני (נוגדן 1.0μg/ml, 0.1% TX-100, 0.1mg/ml RNAse ללא BSA ב PBS) הוא pipetted על parafilm של חדר הכביסה.
    3. בעזרת מלקחיים, coverslips ממוקמים בצד התא מטה אל הפתרון נוגדן ראשוני מותר דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    4. במשך כל coverslip, שתי טיפות 1ml של PBS הם pipetted על parafilm של חדר הכביסה.
    5. כדי להסיר את coverslips מפתרון מכתים נוגדן, 1ml של PBS היא pipetted ליד coverslip. הנוזל צריך להיות נמשך מתחת מדגם ידי כל פעולה נימי.
    6. בעזרת מלקחיים, coverslips מוסרים וכל מושם על ירידה הראשון של PBS עבור 5min ואז הניח על ירידה השני של PBS עבור 5min אחר.
    7. 3.4.2 עד 3.4.6 שלבים חוזרים על עצמם באמצעות פתרון פלורסנט נוגדנים משני (נוגדן 1.0μg/ml, 0.1% TX-100, 0.1mg/ml BSA ב PBS). שים לב כי מאז סמן הזרקה ו-RNA הם גלויים בערוץ ירוק ואדום, את הנוגדן המשני חייב להיות מצומדת לצבוע תואמת, כגון Alexa647.
    8. Coverslips מורכבים כמו 3.3.7.

4. הדמיה כימות

  1. הדמיה
    1. מיקרוסקופ epifluorescence משמש התמונה הבאה הזרקת תאים. התאים מוזרקים יכול להיות ממוקם על ידי איתור את הפצעים לחצות וזיהוי תאים עם סמן מוזרק (OG-dextran).
    2. עבור כל תא ציין, תמונה של מוזרק OG-dextran נרכש. כאשר הדמיה microinjected mRNA חשוב כימות מוגבל התאים קיבלו> 90% הנוזל מוזרק (כלומר dextran) לתוך הגרעין.
    3. תמונה של RNA הוא רכש אז. כדי לאפשר מדידה מדויקת של RNA, את זמן החשיפה בין כל התאים בתוך זמן נתונה כמובן צריך להישאר קבוע ליפול בטווח הדינאמי של המצלמה. באופן אידיאלי כל תמונה צריכה לכלול תא uninjected כדי להיות מסוגל לחשב נכונה את הרקע הקרינה Intensity (ראה 4.2.4).
    4. כדי לסייע כימות, תמונה של DAPI כתם יכול להיות גם נרכש. גם אם immunofluorescence בוצעה, החלבון מוכתם יכול להיות גם הדמיה. דוגמה הפצה mRNA בנקודות שונות במהלך זמן מוצג באיור 4. MRNA המקודד חלבון המופרש והוא ממוקד ובכך למיון ב COS-7 תאים. שים לב ER-מיקוד אומתה על ידי שיתוף מכתים את הרנ"א עם נוגדנים נגד TRAPα, חלבון תושב ER 11.
  2. קביעת כמות

    ניתן להשיג עם מספר שונה של ניתוח תמונה חבילות תוכנה. ImageJ תוכנה הוא מתאים היטב לכימות הפצה mRNA הסלולר מאז ניתן להשתמש בו באופן ידני נפרד שברים גרעיני cytoplasmic, הוא יכול למדוד את הקרינה הממוצעת של שברים אלו, נתוני התפוקה שלה ניתן להעתיק בקלות ולהדביק לתוך תוכנות אחרות, כגון Microsoft Excel.
    1. תמונות המקביל דגים, OG-dextran, ו DAPI הקרינה נפתחים הממוזג באמצעות תמונות כדי סטאק הכלי.
    2. ב גם את DAPI או dextran שכבת הכלי סף משמש כדי לבודד את האזור המתאים לגרעין microinjected. חלק זה נבחרה באמצעות הכלי שרביט, ולאחר שעבר שכבת דגים, אזור (Nuc) ו אומר / ממוצע עוצמת (F Nuc) נרשמות שימוש בכלי מדידה.
    3. המערכת התא מתוארת באמצעות הכלי בחירה Freehand, ואף על שכבת דגים באזור (טוט) ו אומר / עוצמת הממוצע (F טוט) נרשמות שימוש בכלי מדידה. אם הקרינה של הסלולרי שלך הוא חזק באופן משמעותי יותר מזה של הרקע, אתה יכול להשתמש בכלי סף במקום הבחירה Freehand כלי להתוות התא הרצוי.
    4. שימוש בפונקציה הבחירה מלבני, תיבת נמשך מעל תא uninjected ועוצמת אומר / הממוצע (F חזור) נרשם.
    5. כל המדידות מועתקים עבודה של Excel.
    6. MRNA מיוצא מחושב באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-1
      Nuc שטח של גרעין
      טוט שטח של התא כולו
      F Nuc הקרינה ממוצע של חלק הגרעין
      F טוט הקרינה ממוצע של שבריר התא כולו
      F חזור הקרינה ממוצע של תא untransfected

      עבור כל נקודה בזמן ייצוא% הממוצע מחושב זממו לאורך זמן.
    7. יציבות mRNA מחושב על ידי מתכננים את הקרינה הממוצעת mRNA הכולל (x טוט (F טוט - F חזור)) לאורך זמן. בדרך כלל אנו מוצאים כי כמות ה-mRNA משתנה מאוד בין תאים ובין coverslips. זה יכול להיות בגלל חוסר עקביות בין ספיקות המחט בין היעילות של FISH מכתים.

figure-protocol-2
באיור 1. תאים coverslip Microinjection. גדלים עד שהם ומחוברות 70-90% פצוע אז אנכית ואופקית בעזרת קצה 200μl פיפטה פלסטיק. החל מ פצע הנגדית, התאים מוזרקים לאורך קצה אחד הפצע (חץ).

figure-protocol-3
איור 2. הרגולטור מזרק. א) תרשים זרימה המדגים כיצד הרגולטור מזרק מורכב. ב) סכמטי של המנגנון המורכב. ג) תצלום של הרגולטור את המזרק התאספו.

figure-protocol-4
איור 3. ההשפעות של α-amanitin על שעתוק של דנ"א פלסמיד שהוחדר. NIH3T3 תאים פיברובלסטים, שהיו טרום שטופלו משתנה הריכוזים של α-amanitin, הוזרקו t-FTZ Δi-DNA פלסמיד ו OG-מצומדות 70kD dextran. התאים מוזרקים הודגרו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ואז קבוע מוכתם עבור t-mRNA FTZ-Δi באמצעות FISH ספציפי probe6. כל שורה המתאים לשדה בודד להציג הדמיה עבור OG-70kDa dextran ו-T-FTZ Δi-mRNA. שים לב גבוה, אך לא נמוך, ריכוזי התרופה לחלוטין עכבות הייצור של תמליל t-FTZ-Δi. בר סולם = 15μm.

figure-protocol-5
figure-protocol-6
איור 4. כמובן זמן של יצוא mRNA גרעיני. COS-7 הוזרקו תאים עם DNA-t-FTZ Δi פלסמיד ו OG-מצומדות 70kD dextran. 30 דקות לאחר הזרקת תאים שטופלו α-amanitin וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך נקודות הזמן המצוין. התאים היו קבועים אז מוכתם בדיקה נגד mRNA-t-FTZ Δi עם נוגדנים נגד סמן TRAPα ER. כל שורה המתאים לשדה אחד של תאים. א) ה-mRNA הפצה הבאים timecourse microinjection. ב) לפוצץ של נקודת זמן 120min מ - (A), הממחיש את שיתוף לוקליזציה של t-mRNA FTZ-Δi ואת ER. כיסוי של t-mRNA FTZ-Δi (ירוק) ו TRAPα (אדום) מכתים מוצג בפאנל הימני. סולם ברים = 15μm.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מספר תהליכים תאיים שונים. בניגוד transfection התא קונבנציונאלי, microinjection מאפשרת לחוקר ביעילות להציג חומצות גרעין לתוך גרעין התא בתוך פרק זמן צר מאוד. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוחים הקינטית כגון קביעת שיעורי הייצוא mRNA, לוקליזציה mRNA, ואת סינתזת החלבון. יתר על כן, מאז הזמן של הניסוי היא קצרה יחסית, ניתן לחשוף תאים תרכובות רעילות בתוך בפרקי זמן קצרים ללא גביית תופעות pleiotropic. יתר על כן, מעכבות או גירוי תרכובות כגון חלבונים שלילי דומיננטי, יכול להיות שותף מוזרק עם חומצות גרעין. לבסוף, microinjections למנוע את הדרישה ריאגנטים transfection, אשר לעתים רעיל לתאים ועלול להפריע תפקודים תאיים שונים.

mRNA לעומת זריקות ה-DNA פלסמיד

הבחירה בה חומצות גרעין להזריק יהיה תלוי מספר שיקולים. בעקבות הזרקת פלסמיד דנ"א, RNA פולימראז II לא רק מסנתז mRNA, אלא גם מגייסת גורמים חלבון תמליל המתהווה 12,13. מאז גורמים אלה חלים אירועים כגון עיבוד mRNA, יצוא גרעיני לוקליזציה cytoplasmic, זריקות DNA פלסמיד יכול לשמש כדי להעריך כיצד הוא תעתיק מצמידים את תהליכי במורד הזרם. למרות שעתוק עשוי להיות יחד לייצא גרעיני 14, מצאנו כי מזריקים mRNA מיוצא מעט מהר יותר מאשר ב-mRNA עיבד vivo 6. הסיבות לכך אינן ברורות כרגע, אך תוצאה זו עשויה לרמוז כמו mRNA מסונתז החדש עולה RNA פולימראז II, זה עשוי להיות קשור מתחמי כי יצוא לעכב גרעיני.

יש כמה יתרונות עם זריקות mRNA. ראשית, החוקר לא חייב להשתמש מעכבי RNA פולימראז, אשר עשוי להשפיע על האופן שבו תאים מווסתים את חילוף החומרים הכללי של רנ"א. שנית, RNA יכול להיות שונה במבחנה לפני הזריקה. למשל, mRNAs יכול להיות מסונתז עם כובע "5 אנלוגים שונים או פולי (א) אורך הזנב על מנת להעריך כיצד תכונות אלה משפיעות על הייצוא הגרעיני 6. שלישית, הסכום המדויק של רנ"א מוזרק ניתן להעריך בגסות. בעקבות פרוטוקול שתוארו לעיל, אנו מעריכים כי כ -20,000 עד 50,000 מולקולות מוזרקים בגרעין אחד, שהוא קטן יחסית בהשוואה למספר הכולל של תמלילי בתא יונקים אופייני (400,000 עד 850,000 מולקולות) 15. החיסרון העיקרי עם זריקות mRNA היא כי במהלך microinjection, כמה דליפה של נוזל הזרקה לתוך הציטופלסמה היא בלתי נמנעת. מאז ה-mRNA מוזרק ישירות לתוך הציטופלסמה היא יציבה לאורך תקופות ארוכות (א Palazzo, תצפית לא פורסם), טיפול נוסף יש לנקוט כדי לבחור את התאים לכימות. בדרך כלל אנו מנתחים את התאים שקיבלו> 90% נוזל הזרקה בגרעין, כפי שנבחנו על ידי חלוקת OG-dextran.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות גומז א עצה שימושית וא ויילד עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק כדי AFP מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (FRN 102,725).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בופר הזרקהSigma-Aldrich140 mM KCl ו-10 mM HEPES, pH 7.4
Oregon Green 488-70kD DextranInvitrogenD7173ניתן לאחסן תמיסת מלאי בריכוז של 10mg/ml בבופר להזרקה למשך תקופות זמן ממושכות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.°C
צינורות קפילריים מבורוסיליקטWorld Precision Instruments, Inc.1B100F-4
טיפים לפיפטה לטעינת ג'ל עבור מחטי הזרקהEppendorf022351656
מיקרוסקופמכשירי NikonEclipse Ti-S
מיקרו-מניפולטורNarishige InternationalNT-88-V3MSH
מזרק להזרקהBD Biosciences512311
בופר PBSSigma-Aldrich137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
בופר SSCSigma-Aldrich150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4
4% פאראפורמאלדהידמדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית15686מנת מלאי של 37% פראפורמלהיד (Paraformaldehyde) מדוללת ב-PBS
0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)Thermo Fisher Scientific, Inc.28314מלאי של 10% Triton X-100 מדולל ב-PBS
פורממידFisher ScientificF84-1
דקסטראן סולפטFisher ScientificBP1585-100
<מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)>*E. coli* tRNASigma-AldrichR1753
קומפלקס ונאדיל ריבוסיד (VRC)Sigma-AldrichR3380
נייר סינון WhatmanVWR international28298-020
שולחן לביטול רעידותמערכות קינטיות5702E-3036-21
Fluoromount GSouthernBiotech0100-20
α-אמניטין (-amanitin)Sigma-AldrichA2263
ParafilmFisher Scientific13-374-12
מכשיר למתיחת מיקרופיפטות בשיטת השריפה/בראון (Flaming/Brown Micropipette Puller)Sutter Instrument Co.P-97
גריס ואקוםDow Corning695400008
T7 RNA פולימראזNew England BiolabsM0251S
פולי(A) פולימראזAmbionAM1350
בופר היברידיזציהSigma-Aldrich100mg/ml דקסטראן סולפט, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM נתרן ציטראט, 0.5mg/ml <מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)>*E. coli* tRNA, 60% פורממיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, M. J., Reed, R. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).
  2. Bossie, M. A., Silver, P. A. Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).
  3. Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans. Genes Dev. 22, 66-78 (2008).
  4. Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).
  5. Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).
  6. Palazzo, A. F. The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA. PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).
  7. Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).
  8. Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science. 303, 836-839 (2004).
  9. Keller, H. E. Proper alignment of the microscope. Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).
  10. Mathews, D. H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).
  11. Görlich, D. The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents. J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).
  12. Perales, R., Bentley, D. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).
  13. Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).
  14. Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
  15. Carter, M. G. Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, 61-61 (2005).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FISHDNARNA

מאמרים קשורים