כימות עמילואידים הנגרמים על ידי זיהום חיידקי באמצעות פלואורסצנציה של תיופלבין T

תקציר

מקור: Balczon, R., et al. שיטות לאיתור עמילואידים ציטוטוקסיים בעקבות זיהום של תאי אנדותל ריאתיים על ידי Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לכימות עמילואידים בתרבית סופרנטנטים מתאי אנדותל ריאתיים הנגועים בחיידקים אלימים, באמצעות תיופלווין T, צבע פלואורסצנטי הנקשר למבני יריעות בטא עמילואיד. עלייה בקרינה בהשוואה לקו הבסיס מצביעה על נוכחות של עמילואידים בתרבית.

פרוטוקול

1. אנליזה של סופרנטנטים ציטוטוקסיים

1. כדי לבצע בדיקת תיופלבין T (ThT), השתמש בפלואורסצנטיות ThT כדי לכמת עמילואידים בסופרנטנטים. עבור מדידות אלה, השתמש בסופרנטנטים מעוקרים על ידי מסנן.
   1. הכן תמיסת מלאי (50x) של ThT על ידי השעיית 8 מ"ג ThT בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) של 10 מ"ל. לאחר הערבוב, סנן את התמיסה דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים.
   2. למדידות, הוסף 20 מיקרוליטר של מלאי ThT ל-1 מ"ל של PBS בקובט ספקטרופוטומטר של 1 מ"ל. הנח את הדגימה המדוללת בספקטרופלואורומטר.
   3. מדוד את פליטת הקרינה הבסיסית באמצעות עירור של 425 ננומטר וסריקת פליטת הקרינה מ-450-575 ננומטר במרווחים של 2 ננומטר.
   4. בצע סריקת זמן-lapse באמצעות עירור של 425 ננומטר ופליטה של 482 ננומטר, עם נתונים המתקבלים כל 0.2 שניות למשך 60 שניות.
   5. 20 השניות הראשונות של סריקת זמן-lapse מודדות פלואורסצנטיות בקובטה הריקה. לאחר 20 שניות, השהה את הסריקה והוסף 10 מיקרוליטר של הסופרנטנט המעוקר בפילטר לקובטה. מערבבים את הקובט בהיפוך ואז מחזירים אותו לספקטרופלואורומטר.
   6. המשך את הסריקה מבוססת הזמן, וקבל את 40 השניות האחרונות של הנתונים.
   7. עם השלמת סריקת הזמן-lapse, בצע סריקת ספקטרום פליטת פלואורסצנטי סופית באמצעות הגדרות זהות, כמפורט בשלב 1.3.

חומרים