בדיקת חממת מטבעות לחקר אינטראקציות תחרותיות בין זני חיידקים

תקציר

מקור: Speare, L., et al. בדיקת חממת מטבעות לכימות אינטראקציות תחרותיות בין מבודדי Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בדיקת דגירה משותפת המשמשת לחקר האופן שבו זני חיידקים מתחרים בסביבה משותפת. הוא מיושם באופן נרחב במיקרוביולוגיה כדי לזהות מנגנונים, כגון הרג תלוי מגע או הרג שאינו תלוי במגע, המניעים אינטראקציות אלה.

פרוטוקול

1. זני תפירת מטבעות (איור 1B, C)
   1. מערבבים את זן הייחוס וזן המתחרה ביחס של 1:1 (v/v) על ידי הוספת 100 מיקרוליטר מכל זן (מנורמל ל-OD 1.0) לצינור צנטריפוגה מסומן של 1.5 מ"ל. כבקרה, ערבב את זן הייחוס עם גרסה מתויגת דיפרנציאלית של עצמו (זן ייחוס pVSV102 + זן ייחוס pVSV208). בקרה זו נדרשת לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר כדי לקבוע אם נוכחותו של זן מתחרה משפיעה על צמיחת זן הייחוס. מערבולת את תרבית הזנים המעורבים למשך 1-2 שניות.
      הערה: שלב זה עשוי לדרוש אופטימיזציה מכיוון שיחס ההתחלה יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות וייתכן שיהיה צורך להתאים אותו.
   2. חזור על שלב 1 עבור כל שכפול ביולוגי. לאחר השלמת שלב זה, אמורים להיות בסך הכל שמונה צינורות מתח מעורבים: ארבעה שכפולים ביולוגיים עם זני ייחוס מתויגים באופן דיפרנציאלי (בקרה), וארבעה שכפולים ביולוגיים עם זני ייחוס ומתחרים מתויגים באופן דיפרנציאלי (ניסיוני).
   3. הבחין ב-10 מיקרוליטר מכל תערובת בקרה וניסוי על צלחות פטרי המכילות אגר LBS; כתמי תרבית אלה ישמשו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הדגירה.
   4. הניחו לכתמים להתייבש לחלוטין על הספסל עד שכל הנוזלים נספגו באגר, ודגרו על צלחות הפטרי בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. נדרשות מינימום של 15 שעות כדי שזני V. fischeri המתויגים ב-pVSV102 ו-pVSV208 יגדלו לצפיפות תאים גבוהה מספיק כדי לדמיין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), בהתאמה, ברמת האוכלוסייה באמצעות מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי. כאן, אנו משתמשים בדגירה של 24 שעות להדמיית כתמים מעורבים.
      הערה: חשוב להשתמש בצלחות שאינן לחות מדי או יבשות מדי. אם הלוחות לחים מדי, כתמי המטבעות לא ייספגו בצלחת האגר; הימנע משימוש בצלחות שנמזגו באותו יום. אם הלוחות יבשים מדי, עלולים להיווצר גלים קטנים או סדקים על פני האגר, מה שהופך את כתמי המטבעות לבלתי סדירים בצורתם.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה הממחיש את מבחן חמדת המטבעות. (A) זני חיידקים המכילים pVSV102 (זן ייחוס מסומן Ref. Strain או R.S.) או pVSV208 (זן מתחרה המצוין Comp. Strain או C.S.) גדלים בנפרד על מדיה סלקטיבית עבור זן הייחוס (LBS Kan) או הזן המת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	פישר	05-408-129
פיפטה רב-ערוצית 10 μL
פיפטה רב-ערוצית 100 μL
פיפטה רב-ערוצית 300 μL
פיפטה חד-ערוצית 10 μL
פיפטה חד-ערוצית 20 μL
פיפטה חד-ערוצית 200 μL
פיפטה חד-ערוצית 1000 μL
צלחות 24 באר	פישר	07-200-84	סטרילי עם מכסה
צלחות פטרי	פישר	FB0875713	סטרילי עם מכסה
מערכת מתנע TipOne 0.1-10 μL	ארה"ב סיינטיפיק	1111-3500	10 מתלים
מערכת מתנע TipOne 200 μL	ארה"ב סיינטיפיק	1111-500	10 מתלים
מערכת התנעה TipOne 1000 μL	ארה"ב סיינטיפיק	1111-2520	10 מתלים
מדיה LBS
1M Tris Buffer (pH ~ 7.5)			50 מ"ל 1 מאגר מלאי 1 מ' (62 מ"ל HCl, 938 מ"ל DI מים, 121 גרם בסיס Trizma)
אגר	פישר טכני	DF0812-17-9	15 גרם (הוסף רק לצלחות)
מים DI			950 מ"ל
נתרן כלורי	פישר	S640-3	20 גרם
טריפטון	פישר	BP97265	10 גרם
תמצית שמרים	פישר	BP9727-2	5 גרם