$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. בדיקת ציפוי
הערה: בדיקת הציפוי מודדת את ריכוז התאים המסוגלים ליצור יחידה יוצרת מושבה (CFU) בדגימות התרבית. הליך זה חושף את הקצב שבו תא אחד מתחלק לשני תאים ברי קיימא ומאפשר זיהוי של עצירות חלוקת תאים (למשל, עלייה בזמן יצירת החיידקים של ליזיס תאים).
- הכן דילולים סדרתיים פי 10 עד 10-7 מתוך 200 מיקרוליטר של דגימת תרבית במדיום טרי. צלחת 100 מיקרוליטר של הדילול המתאים על לוחות אגרוז לא סלקטיביים של לוריא-ברטאני (LB) כדי להשיג בין 3-300 מושבות לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס.הערה: יש לבצע דילול סדרתי במדיום טרי במהירות כדי להגביל את חלוקת החיידקים. לחלופין, חוקרים עשויים לשקול להשתמש בתמיסת מלח ללא מקור פחמן כדי למנוע חלוקת תאים במהלך תהליך הדילול.
- למחרת, ספרו את מספר המושבות כדי לקבוע את ריכוז התאים ברי קיימא (CFU/mL) בכל דגימת תרבית. שרטט את ה-CFU/mL כפונקציה של זמן עבור תרביות תאים לא מטופלות ומטופלות.
2. ציטומטריית זרימה
הערה: הסעיף הבא מתאר את הכנת דגימות התאים לניתוח ציטומטריית זרימה. טכניקת ניתוח זו חושפת את התפלגות גודל התא ותכולת ה-DNA עבור מספר רב של תאים. במידת האפשר, מומלץ לעבד את דגימות הזרימה הציטומטרית באופן מיידי. לחלופין, ניתן לשמור דגימות על קרח (עד 6 שעות) ולנתח אותן בו זמנית בסוף היום, לאחר ביצוע הציפוי והדמיית המיקרוסקופיה.
- לדלל את 250 מיקרוליטר של דגימת התרבית כדי לקבל 250 מיקרוליטר בריכוז של ~15,000 תאים/מיקרוליטר (המתאים ל-OD600 ננומטר ~0.06) במדיום טרי ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: דגירה על קרח תגביל את הצמיחה והשינוי המורפולוגי של התאים. לחלופין, המשתמש עשוי לשקול לבצע קיבוע של התאים באתנול 75%, כפי שמומלץ בדרך כלל לציטומטריית זרימה. - לצורך צביעת DNA, מערבבים את דגימת החיידקים עם תמיסה של 10 מיקרוגרם/מ"ל של צבע פלואורסצנטי DNA (יחס 1:1) ודוגרים בחושך למשך 15 דקות לפני ניתוח הדגימה.
- העבירו את הדגימה לתוך ציטומטר הזרימה עם קצב זרימה של ~120,000 תאים לדקה. רכוש אור מפוזר קדימה (FSC) ומפוזר צדדית (SSC) כמו גם אות פלואורסצנטי של צבע פלואורסצנטי DNA (FL-1) עם ההגדרות המתאימות.
- התווה את ההיסטוגרמות של צפיפות התאים FSC ו-FL-1 כדי לייצג את התפלגות גודל התא ותכולת ה-DNA באוכלוסיית התאים.