אבולוציה אדפטיבית של חיידקים באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית

תקציר

מקור: Jian, X., et al., טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים את השימוש במערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית כדי להניע אבולוציה אדפטיבית של חיידקים לקראת סבילות למתנול. על ידי ערבוב תרביות חיידקים מהונדסות עם מדיום עקה עתיר מתנול ופילוח שלהן למיקרו-טיפות, המערכת בוחרת מוטציות המציגות צמיחה משופרת תחת עקת מתנול. באמצעות מחזורי העשרה איטרטיביים ובידוד מושבה, זני חיידקים מותאמים למתנול מתורבתים להמשך ניתוח או יישום.

פרוטוקול

התפתחות אדפטיבית ב- MMC

1. הכנה לתמיסת החיידקים הראשונית
   1. פעל לפי התקנות הסטנדרטיות הקשורות להכנת הלוחות הנוזליים, הבינוניים והמוצקים המיוחדים עבור ה-MeSV2.2 והחיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   2. טפחו את ה-MeSV2.2 באמצעות הצלחת המוצקה (קוטר = 90 מ"מ) באינקובטור בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר מכן, בחרו מושבה עצמאית וטפחו אותה בבקבוק שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל מהמדיום הנוזלי המיוחד באינקובטור רועד (200 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
   3. יש לדלל את תמיסת ה-MeSV2.2 המתורבתת עם המדיום ל-OD₆₀₀ של 0.1-0.2 (לוודא שהנפח הכולל אינו פחות מ-10 מ"ל) ולהמשיך לטפח אותו בבקבוק הניעור למשך 5 שעות כדי לקבל את תמיסת החיידקים הראשונית.
      הערה: ה-MeSV2.2 הוא זן E. coli החיוני למתנול. המדיום הנוזלי המיוחד מכיל 500 מילימול לליטר מתנול, המהווה לחץ חזק עבור MeSV2.2, וכתוצאה מכך צמיחה איטית מאוד.
2. אתחול ה- MMC.
3. הוצא שני בקבוקי ריאגנטים מעוקרים, אחד מהם מיועד לתמיסת החיידקים הראשונית והשני למדיום הטרי. הזרקו את תמיסת החיידקים הראשונית (5 מ"ל), המדיום הטרי (12-15 מ"ל) ושמן MMC לבקבוקי המגיבים.
   הערה: מכיוון שאבולוציה אדפטיבית היא תהליך ארוך טווח הכולל מספר גידולי משנה, אחסן כמה שיותר מדיום טרי ב-MMC. לא ניתן לחדש את המדיום במהלך הניסוי.
4. התקן את שני בקבוקי הריאגנט לתוך MMC. התקן את האחד עבור תמיסת החיידקים הראשונית בין מחבר C2 ו-O2 והשני עבור המדיום הטרי בין מחבר C4 ו-O4.
5. לחצו על ALE כדי לבחור את הפונקציה של אבולוציה אדפטיבית (איור 1B). בממשק הגדרת הפרמטרים, הפעל את מתג זיהוי OD.

6. הגדר את המספר כ-50, אורך גל כ-600 ננומטר, ריכוז כ-0%, הקלד כזמן, פרמטר כ-30 שעות וחזרות כ-99. לחץ על התחל כדי להתחיל ביצירת טיפות. זה ייקח בערך 25 דקות.
   הערה: כאן, "ריכוז" מתייחס לריכוז המקסימלי של גורמים כימיים לאבולוציה אדפטיבית. עבור טיפות שונות, ניתן לממש ב-MMC להכניס ריכוזים שונים של גורמים כימיים כדי לספק תנאי גידול שונים. חשב את הריכוזים שהוצגו באמצעות המשוואה הבאה:

   

   כאן, "C" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים המוכנסים לטיפות; "a" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי הריאגנטים בין מחבר C4 ו-O4; "b" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיב בין מחבר C6 ו-O6; ו-"i" מתייחס לריכוז הזמין. ישנם שמונה ריכוזים זמינים ב-MMC. מכיוון שלגורם הכימי כאן יש ריכוז יחיד (500 ממול/ליטר מתנול) והוא אחד ממרכיבי המדיום, מותקן כאן רק בקבוק ריאגנט אחד המכיל את הגורם הכימי, והריכוז מוגדר כ-0%. סוג מתייחס לאופן תת-הגידול, המחולק לשלושה סוגים: מצב זמן, מצב ערך OD ומצב פלואורסצנטי. הראשון פירושו לטפח את הטיפות לזמן קבוע ולאחר מכן לעבד משנה, בעוד ששני האחרונים מתכוונים לטפח את הטיפות לערך OD מוגדר מראש/עוצמת פלואורסצנטיות ולאחר מכן לטפח משנה. פרמטר מתייחס לפרמטר הקשור הנדרש בבחירת אופן גידול משנה. חזרות מתייחסות למספר תת-הגידולים.

7. הסר את בקבוק הריאגנט הממוקם בין מחברי C2 ו-O2.
8. שימו לב אם ערכי ה-OD המקסימליים של הטיפות במהלך כל תקופת תת-גידול גדלו באופן משמעותי. אם העלייה מתרחשת ועומדת בדרישות הניסוי, לחץ על כפתור ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה-OD.
   הערה: כאן, תקופת הטיפוח תלויה בפרמטר. לדוגמה, כאשר מגדירים סוג כזמן ופרמטר כ- 30 שעות, תקופת העיבוד היא 30 שעות. במהלך כל תקופת תת-גידול, ישנם ערכי OD מקסימליים של הטיפות. העריכו אם האבולוציה האדפטיבית עומדת בדרישות הניסוי על ידי הגדלת ערכי ה-OD המקסימליים (הגידול תלוי בתהליך הגידול בפועל של הזן, למשל, שגדל ביותר מ-20%). זהירות: שימו לב אם המדיום הטרי המאוחסן מוצה. אם העלייה המשמעותית לא התרחשה גם לאחר מיצוי המדיום, חלץ את הטיפות הגדלות טוב יותר ובצע סבב חדש של אבולוציה אדפטיבית.
9. חלץ את טיפות היעד מה-MMC.
   1. לחץ על כפתור הסינון כדי לבחור את הפונקציה של חילוץ טיפות (איור 1C). בחר באפשרות איסוף, לחץ על מספר טיפות היעד ולאחר מכן לחץ על אישור.
      הערה: סינון טיפות כולל "איסוף", "השלכה" ו"תמצית תמיסת זרעים". "תמיסת מיצוי זרעים" פירושה איסוף הטיפות הנותרות לאחר פעולת תת-הגידול.
   2. המתן עד שהחלון המוקפץ יבקש, "אנא משוך החוצה את המחבר המהיר CF והכנס אותו לצינור ה-EP". הכנס את המחבר המהיר CF לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה לאיסוף בהתאם להנחיית התוכנה ולאחר מכן לחץ על אישור (איור 2D).
   3. לאחר 1-2 דקות, ממשק התוכנה יקפוץ חלון חדש המבקש, "אנא הכנס את המחבר בחזרה ולחץ על אישור אם סיים". לאחר מכן, הכניסו את המחבר המהיר CF בחזרה ולחצו על אישור כדי לגרום ל-MMC להמשיך לפעול (איור 2D).
      הערה: לאחר איסוף כל טיפות המטרה, ה-MMC ימשיך לטפח את הטיפות הנותרות. אם אין צורך בגידול, לחץ על עצור כדי לסיים את הפעולה ישירות.
   4. מחלצים את הטיפה באמצעות פיפטה של 2.5 מיקרוליטר, מפילים אותה על צלחת האגרוז בקוטר 90 מ"מ ומורחים אותה באופן שווה בעזרת מוט פיזור זכוכית משולש באורך צד של 3 ס"מ. לאחר מכן, טפחו אותו בחממה בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
   5. בחרו 3-5 מושבות עצמאיות וטפחו אותן בנפרד בצלוחיות שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל מדיום טרי בחממה רועדת (200 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות. פעל לפי התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי לאחסן את תמיסת החיידקים המתורבתים בצינור הגליצרול לניסויים הבאים.

תוצאות

איור 1: ממשק תוכנת הפעלה של MMC. (A) הממשק הראשי של התוכנה. (1) טמפרטורה בתא הניתוח. (2) ערך האות הפוטואלקטרי של זיהוי טיפות. כאשר הטיפה עוברת, ערך האות גבוה (>2 וולט). כאשר השמן עובר, ערך האות נמוך (<1 וולט). (3)...

חומרים