הכנת לוח מיקרופלואידי עם תאים חיידקיים

תקציר

מקור: סוטלייף, א. ל. ואחרים. ניתוח תאים חיים של מאמץ גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת מיקרופלואידית אוטומטית עם תפוקה גבוהה יותר. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את הכנת לוח מיקרופלואידי למחקרי מאמץ גזירה בתרביות חיידקים. לאחר פריימר התעלות במדיה, תאי חיידק מוכנסים לתעלה הניסיונית ומודגרים לצורך הצמדה. המדיה והתרבות שנותרו מוסרים כדי להכין את המערכת לניסויי מאמץ גזירה עתידיים.

פרוטוקול

1. הכנה למדיה

1. הכינו מדיום מינימלי (MM) עם 0.25% גלוקוז. כדי לייצר 1 ליטר של MM עם גלוקוז 0.25%, מוסיפים 200 מ"ל תמיסת מלח סטרילית M9, 2 מ"ל סולפט מגנזיום סטרילי 1 מ' (MgSO₄), 100 מיקרוליטר סידן כלוריד סטרילי 1 מ' (CaCl₂), ו-12.5 מ"ל גלוקוז סטרילי של 20% (עם גלוקוז) למים (dH₂O) בנפח סופי של 1 ליטר.
2. העברת המדיה הנדרשת לבקבוק סטרילי באמצעות טכניקות סטריליות. הכינו את הכמות הנדרשת בהתאם למספר הערוצים בהם משתמשים. בדרך כלל, כל ערוץ דורש 200 מיקרוליטר לפריימינג, 300 מיקרוליטר לזריעה ו-1300 מיקרוליטר לניסוי של 24 שעות.
3. הנח את הבקבוק באינקובטור או באמבט מים בטמפרטורה הניסויית. המדיה צריכה להיות בטמפרטורת הניסוי לפני השימוש כדי למנוע היווצרות בועות בתעלות המיקרו.

2. הכנת תרבית לילה וניסיונית של זן Pseudomonas aeruginosa PA01 שמבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (PA01-EGFP).

1. הניחו 15 מ"ל מדיום ניסיוני בתוך בקבוק סטרילי של הנשק הצדדי וחסן במושבה אחת או שתיים מפלטת אגר עם פסים של PA01-EGFP. הרחיב את התרבות ל-12-16 שעות על שולחן אינקובטור/שייקר בטמפרטורה של 37°C ו-180-220 סל"ד.
2. מדד את מנת האורגז₆₀₀ של תרבות הלילה. כאשר ה-OD₆₀₀ גדול מ-0.80, יש לדלל את התרבית הלילית ל-OD סופי של 0.8 באמצעות MM טרי. הנח את התרבית הניסיונית באינקובטור או באמבט מים בטמפרטורה של 37°C עד שנדרש לזרעת תעלות מיקרופלואידיות. בדוק שוב את_{ה-OD 600} מיד לפני הזרעה כדי לוודא שהוא לא השתנה משמעותית מהיעד OD₆₀₀, 0.8 במקרה הזה.

3. הקמת ציוד

1. הגדר את תחנת המערכת לפי מדריך המשתמש, בדומה להגדרה באיור 1. כדי למנוע טעות בחיבור המכשיר לתוכנה, יש להפעיל את המכשיר בסדר הבא:
   תחנת עבודה למחשב
   מודול פלואורסצנציה. תוודא שתריס הפלואורסצנציה דולק (אור כחול ליד כפתור התריס דולק)
   בקרי חומרה
   בקר מערכת הדמיה (ראו טבלת חומרים)
   מצלמת CCD
   תחנת הדמיה (מיקרוסקופ)
   הערה: יש לכוון את טמפרטורת הפלטה המחוממת לטמפרטורה הניסויית הרצויה.
2. הפעל את יישום הבקרה והזן את מספר הלוחית שנמצא על התווית בצד הלוח.
   הערה: לאחר תחילת יישום הבקרה, יהיו שני חלונות יישומים נפרדים, אחד לתוכנה ששולטת במיקרוסקופ/תוכנת הדמיה ואחד למודול הבקרה ששולט במשאבה ובממשק הבאר.

4. פריימר וזריעת לוח מיקרופלואידי

הערה: הפריימינג, הזריעה, החיבור החיידקי והצמיחה מוצגים באיור 2.

1. הסר את לוח המיקרופלואיד עם 48 בארות מהאריזה, וודא שלא נוגע במשטח הזכוכית בתחתית הפלטה. נקה את מחסנית הזכוכית בתחתית הפלטה היטב עם טישו עדשה, מטלית ללא סיבים, או מגבון עם סיבים נמוכים.
2. כדי להכין את תעלות המיקרופלואידיות, יש פיפטה של 200 מיקרוליטר של 37 מעלות צלזיוס לתוך באר היציאה, תוך זהירות להימנע מבועות. הכניסו את הפלטה לשלב הפלטה ומנגבים את הממשק באתנול, כדי לאפשר לה להתייבש, לפני שמאבטחים אותה על שלב הצלחת.
3. במצב ידני במודול הבקרה, הגדר נוזל כ-
   לוריה-ברטאני (LB) ב-37 מעלות צלזיוס וגזירה מקסימלית ב-5.00 דיין/ס"^{מ רבוע}. לחץ על בארות היציאה כדי להפעיל את הזרימה מהפלט לבאר הקלט, ולהכין את הערוצים. לאחר הפריימר של 5 דקות, עצרו את הזרימה כדי להתכונן לזריעה. הסר בזהירות את הפלט מהבמה ומהמדיה השארית של הפיפטה מהפלט, אך אל תסיר שום מדיום מהמעגל הפנימי שמוביל לתעלות המיקרופלואידיות.
4. כדי לזרוע את הערוצים הניסיוניים, תחילה פיפטה של 300 מיקרולטר MM אל באר הקלט, ולאחר מכן פיפטה של 300 מיקרו ליטר של תרבית החיידקים לתוך היציאה לבאר היציאה. החזר את הפלטה לשלב הפלטה, ודא שאתה מנקה את הממשק לפני שאתה מניח אותה עליה.
5. במודול הבקרה, התמקדו בערוץ יחיד באמצעות שידור חי של המצלמה לאחר הצבת שלב הפלטה על שלב המיקרוסקופ. בעת ניטור ויזואלי באמצעות שידור חי, ממשיכים לזרום בקצב של 1.00-2.00 דיין/סנטימטר^רבוע למשך כ-2-4 שניות כדי לאפשר לתאים להיכנס לתעלה הניסיונית, אך לא לתעלות הסרפנטיניות. השאירו את הלוח על הבמה המבוקרת טמפרטורה למשך שעה אחת כדי לאפשר חיבור תאים. במהלך הדגירה של שעה, ניתן להגדיר את מודול הבקרה ותוכנת המונטאז' להפעלה אוטומטית.
   הערה: משך הזמן הנדרש לזריעה ישתנה בהתאם למדיה ולאורגניזם, ולכן יש לעקוב אחריו מקרוב על ידי ההזנה החיה עד לאופטימיזציה ושימוש כלוח זמנים כללי. הזריעה לאורך כל הצלחת עשויה להשתנות, מה שידרוש יותר זמן לזרימה לעמודות מסוימות של תעלות לזריעה מלאה.
6. לאחר תקופת ההצברה, הסר בעדינות את הפלטה מהשלב ומפיץ את החיידקים מהפלט תחילה, כדי להימנע מהפרעה לתעלה. עם קצה פיפטה חדש, הסר את המדיה מבארות הקלט.

תוצאות

איור 1: רכיבים בודדים של מערכת המיקרופלואיד. הרכיבים הבודדים מפורטים משמאל לימין: 1. מצלמת CCD, 2. מיקרוסקופ הפוך ברזולוציה גבוהה עם שלב אוטומטי, מודול פלואורסצנציה אוטומטי, ומודול פוקוס אוטומטי, 3. שלב לוחה, 4: ממשק מערכת הדמיה, 5: בקרת של...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלוריד אמוניום, ACS	VWR	BDH9208-500G	חלק מההרכב המינימלי של המדיה
BioFlux 1000 48 באר עם פלטת גזירה נמוכה	ביוסיינס פלוקסיון	910-0047
מערכת ההדמיה המיקרופלואידית BioFlux 1000Z	ביוסיינס פלוקסיון	BF 1000Z
סידן כלוריד דיהידריד, דרגת ACD	VWR	97061-904	חלק מההרכב המינימלי של המדיה
דקסטרוז, אנהידרוס, ACS	VWR	BDH9230-500G	חלק מההרכב המינימלי של המדיה
דרגת מגנזיום סולפט ACS	VWR	EM-MX0070-1	חלק מההרכב המינימלי של המדיה
אשלגן פוספט מונובסיסי, דרגת ACS	VWR	BDH9268-500G	חלק מההרכב המינימלי של המדיה
פסאודומונאס אאורגינוסה GFP	ATCC	15692GFP	זן חיידקי Pseudomonas aeurinosa PA01 עם שינוי GFP שימש למחקר זה.
כלוריד נתרן, ACS	VWR	BDH9286-500G	חלק מההרכב המינימלי של המדיה
נתרן פוספט, מונובסיסי, אנהידרוסי, דרגת ריאגנט	VWR	97061-942	חלק מההרכב המינימלי של המדיה