1. הערכת ספציפיות של מיקוד microRNA: בדיקת התפשטות נגיפית באמצעות ממיתי (Mimics) microRNA סינתטיים
הערה: השימוש במימטיק (mimic) סינתטי של microRNA מבוצע כדי להראות את הספציפיות של האינטראקציה בין ה-microRNA למטרה של ה-microRNA.
- יש לכלול בבדיקה כל אחת להערכת רעילות המתווכת על ידי microRNA בקרות של טרנספקציה מדומה (mock transfection), ממסך (mimic) של microRNA כביקורת שלילית, ובקרות של ממסך microRNA ניסויי בלבד. כמו כן, מומלץ לכלול ביקורת חיובית (כלומר, גן או גנום המהווים מטרה ל-microRNA), מכיוון שאתה יעילות טרנספקציה נמוכה של ממסכי microRNA עלולה להוביל לתוצאות שגויות שליליות.
- זריעו תאי H1-HeLa בצלחת תרבית רקמות בעלת 96 בארות, כך שיהיו בדרגת התמזגות (confluency) של 80-90% במועד הטרנספקציה (24 שעות לאחר הזריעה). זריעו את התאים ב-DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) מועשר ב-10% סרום בקר עוברי (fetal bovine serum) בנפח של 0.1 מ"ל לבאר.
הערה: בצעו בדיקה זו בתאים המאפשרים שכפול נגיפי שאינם מבטאים את ה-microRNAs ההומולוגים. - חממו את ריאגנטי הטרנספקציה לטמפרטורת החדר. ערבבו 9 µL מדיום ללא סרום, ריכוז סופי של 200 nM למבחנה (well) של מלאי ממיר microRNA, 0.18 µL boost reagent, 0.18 µL סוכן טרנספקציה, וערבב. דגרי את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 2–5 דקות.
הערה: הנפחים המצוינים הם לכל באר. מומלץ להכין תערובת מאסטר (master mix) עבור הטרנספקציה של כל הבארה כדי לשמור על עקביות ולמזער שגיאות פיפטור. הריכוז האופטימלי של ממטר (mimic) ה-microRNA ישתנה. יש לעיין בהוראות היצרן המצורפות לממטר ה-microRNA כדי לקבוע ריכוז התחלה סביר. ריכוז זה יהיה בדרך כלל בטווח של 5–200 nM כריכוז סופי. - שאבו את המצע מהבארים והוסיפו 92 µL של מצע מלא טרי.
הערה: אם יש מספר משמעותי של דגימות, השלימו שלב זה לפני הכנת תמיסת הטרנספקציה ואחסנו את הפלטה ב- 37 °C עד אשר יהיו מוכנים. - הוסיפו את כל תערובת הטרנספקציה לתאים בטיפות.
- דגרו ב- 37 °C במשך 6 שעות.
- הדביקו כל באר ב-MOI (ריבוי זיהום) נמוך כדי להבטיח שרק אחוז נמוך מהתאים יודבקו, ובכך לאפשר את ניתוח התפשטות הנגיף. פרוטוקול זה משתמש ב-MOI של 0.2.
- דללו את מלאי הווירוס במצע ללא סרום לריכוז של MOI = 0.2 ל- 100 µLשאבו את המדיום מהבארים והוסיפו 100 µL של דילול הנגיף לכל באר.
- דגרו ב- 37 °C למשך שעתיים.
- שאבו את המצע מכל באער והוסיפו 100 µL של מצע מלא טרי.
- דגרו ב- 37 °C למשך 20-22 שעות.
- קבעו את טיטר הנגיף במעלי הדמעות (supernatants).
- אסוף את העלייה (supernatant) מכל באר והחלף אותה ב- 100 µL של מצע מלא טרי.
הערה: במידה שנעשה שימוש בתאי התלייה, השביה מחדש את משקעי התאים מהשלב הבא ב- 100 µL של מצע מלא טרי והחזר לבאר הדגימה לצורך בדיקת החיוניות. - הסר פסולת תאית מהעלים שנאספו באמצעות סבוב במ centri-fuge ב-300 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C.
- העבירו את העל-נוזל (supernatant) המזוהה לפחלון חדש ותרמידו את הנגיף הזיהומי על תאים רגישים שאינם מבטאים את ה-microRNAs ההומולוגיים.
הערה: שמרו את כל הדגימות על קרח כדי למנוע אובדן של יכולת ההדבקה.
