הפקה של נגיף חצבת רקומביננטי המקודד לחלבון מעורר מערכת חיסונית

תקציר

מקור: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. פראמיקסו-וירוסים לאימונומודולציה ממוקדת גידולים: תכנון והערכה Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את יצירתם של נגיעי חצבת רקומביננטיים באמצעות ליפוזומים להחדרת פלסמידים המקודדים את האנטי-גנום הנגיפי וחלבונים עזריים חיוניים לתוך תאי ייצור. ה-RNA המשוכתב והמשוכפל מוביל ליצירת חלקיקים נגיפיים המבטאים חלבונים מעוררי מערכת חיסונית וחלבונים פלואורסצנטיים למעקב. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להדמות היווצרות של סינציטיה (syncytia), דבר המאשר ייצור מוצלח של נגיף רקומביננטי.

פרוטוקול

הערה: [O], [P], ו-[M] מציינים תתי-סעיפים הרלוונטיים ל: וירוסים אונקוליטיים (OVs) באופן כללי, (רוב) הפרמיקסו-וירוסים, או וירוס החצבת (MV) בלבד, בהתאמה. [B] מציין סעיפים ספציפיים עבור טרנס-גנים של מעוררי תאי T דו-סגוליות (BTE).

1 שיבוט של טרנסגנים המקודדים לאימונומודולטורים לתוך וקטורים של נגיף החסבת

1. [O] תכנון רצף המבנה (insert).
   1. [O] קבעו את האימונומודולטור הרצוי על בסיס סקירת ספרות או נתונים גששים כגון סריקות גנטיות, והוציאו את רצף ה-cDNA (complementary DNA) הרלוונטי ממאגרי מידע מתאימים כגון GenBank, ה-European Nucleotide Archive, או מערכת המידע הבינלאומית ImMunoGeneTics (IMGT).
   2. [O] הוסיפו מאפיינים נוספים לרצף הגן המועבר (transgene) (איור 1). רצף Kozak קודם ואופטימיזציה של קודונים (codon optimization) ספציפית למין יכולים לשפר את הביטוי. רצפי אות (signal sequences) נדרשים להפרשה. כללו רצפים המקודדים לתגים חלבוניים בקצה ה-N ו/או C לצורך זיהוי וטיהור. כללו אתרי הגבלה (restriction sites) להחדרה אל הווקטור.
      הערה: [M] יחידות שעתוק נוספות (ATUs) המכילות אותי התחלה וסיום של גן הפולימראז של MV נחוצות לביטוי הגן המועבר מתוך גנומים של MV רקומביננטיים. ווקטורי cDNA אנטי-גנומיים מתאימים, הנשלטים על ידי מקדמי cytomegalovirus (CMV) ומכילים ATUs עם אתרי הגבלה ייחודיים להחדרה של גנים מועברים בעלי חוט חיובי במיקומים מוגדרים, פותחו בעבר. [P] מיקום הולם של הגן המועבר הוא קריטי, שכן הוא משפיע על השכפול הוויראלי ועל ביטוי הגן המועבר בשל מדרג הביטוי האופייני ל-paramyxoviruses. החדרה ל-ATU הקרוב לקצה ה-3' של האנטי-גנום (כלומר, במיקום ה-leader או במורד הגן P) מובילה בדרך כלל לביטוי גבוה של הגן המועבר על חשבון שכפול ויראלי מופחת. ניתן לצפות לשכפול מוגבר ורמות נמוכות יותר של ביטוי הגן המועבר בעת שימוש ב-ATU במורד הגן H. אריזה של הגנום של מספר paramyxoviruses, כולל נגיף החצבת, דורשת קישור של שישה נוקלאוטידים על ידי כל חלבון נוקלאוקפסיד. לצורך החדרת גנים מועברים לווירוסים אלו, ודאו שמספר הנוקלאוטידים של הגנום השלם ניתן לחלוקה בשש. דבר זה מכונה גם "כלל השש" (rule of six). במידת הצורך, הוסיפו נוקלאוטידים נוספים במבנה (במעלה רצף ה-Kozak או במורד קודון העצירה) מבלי להחדיר הסטות מסגרת (frame shifts) או קודוני עצירה מוקדמים. [M] הימנעו מרצפים ספציפיים בגן המועבר הדומים לאותי התחלה (AGGRNCMARGW) וסיום (RTTAWANAAAA) של גני MV ומרצפי עריכת RNA (AAAAAGGG).
   3. [O] רכשו אוליגונוקלאוטידים ברצף הרצוי או הרכיבו אותם מרצפים זמינים באמצעות שיטות שיבוט מולקולרי סטנדרטיות.
      הערה: [O] לצורך הגברה של הגן המועבר באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), תכננו פריימר קדמי (forward primer) הכולל את אתר ההגבלה במעלה הרצף ואת 15-20 הנוקלאוטידים הראשונים של המבנה, ופריימר אחורי (reverse primer) הכולל את 15-20 הנוקלאוטידים האחרונים של המבנה ולאחריהם את אתר ההגבלה במורד הרצף.
2. [O] שיבוט המבנה לתוך DNA המקודד את (אנטי-) הגנום הוויראלי.
   1. [O] שבטו את המבנה לתוך ווקטורי DNA או אנטי-גנומי DNA של נגיפי RNA בשיטות שיבוט מולקולרי סטנדרטיות (כלומר, הגבלה אנזימטית ולאחריה ליגציה של DNA).
      1. [O] מנעו ליגציה חוזרת של הווקטור על ידי שימוש באתרי הגבלה שאינם תואמים או על ידי דה-פוספורילציה לפני הליגציה.
      2. [O] בדלו את תוצר הליגציה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ובניקוי ג'ל לאחר מכן באמצעות ערכות זמינות מסחרית. באופן כללי, יעילות ליגציה אופטימלית מושגת ביחס מולרי של 3:1 בין המבנה לווקטור.
   2. [O] העבירו (transform) את תוצר הליגציה לחיידקים קומפטנטיים המתאימים לשחזור יעיל של פלסמידים גדולים (כלומר, בצעו הלם תרמי של E. coli) וזהו קלונים חיידקיים הנושאים את ה-DNA הנכון באמצעות colony PCR.
   3. [O] בדלו DNA מוגבר מקלון חיידקי בודד באמצעות ערכות להכנת DNA הזמינות מסחרית. אששו את השלמות הגנומית על ידי עיכול בקרה עם אנזימי הגבלה מתאימים (למשל, HindIII לגנומים של MV [M]). אששו את ההחדרה הנכונה ואת שלמות הגן המועבר באמצעות ריצוף.
      הערה: [M] עבור גנים מועברים שהוחדרו ל-MV H-ATU, בצעו ריצוף סנגר עם הפריימרים הבאים: H-9018 [פריימר קדמי, נקשר למיקום 9018 בגנום MV במסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של H]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (פריימר אחורי, נקשר למיקום 9249 בגנום MV ב-L ORF): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. בידוד חלקיקי נגיף חצבת רקומביננטיים המקודדים לאימונומודולטורים

1. [O] ייצור חלקיקי נגיף רקומביננטיים מ-DNA (אנטי-)גנומי באמצעות טרנספקציה של תאי ייצור נגיף, על פי הפרוטוקול הסטנדרטי עבור הנגיף הרלוונטי. יש לפעול לפי ההנחיות לעבודה בתנאים סטריליים. יש לבצע את תרבית התאים תחת מנדף, ובמיוחד את כל השלבים הכוללים נגיף בתוך קבינט בטיחות ביולוגית Class II.
   1. [M] להצלה של נגיפי חצבת מ-cDNA, יש לזרוע תאי ייצור MV (תאי Vero המופקים מכליות של קוף ירוק אפריקאי) באופן אחיד בלוח 6 בארות 24 שעות לפני הטרנספקציה. יש לזרוע 2 x 10⁵ תאים ב-2 mL של Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) המכיל 10% fetal bovine serum (FBS) לכל בארה, כדי להגיע ל-65–75% התמזגות (confluency) בזמן הטרנספקציה.
      הערה: [P] יש להפחית את מספר התאים אם התאים גדלים יתר על המידה לפני היווצרות הסינציטיום המושרה על ידי הנגיף.
   2. [P] בצע טרנספקציה לתאים עם DNA המקודד לאנטי-גנום של הנגיף, פלסמידי עזר נדרשים, ובמידת הצורך, פלסמיד המקודד לחלבון דווח פלורוצנטי להערכת יעילות הטרנספקציה.
      1. [M] ערבב 5 µg של DNA רקומביננטי המקודד לאנטי-גנום של נגיף החצבת, 500 ng מכל אחד של פלסמידי ביטוי לממליפרים המקודדים לחלבוני N ו-L של נגיף החצבת, ו-100 ng מכל אחד של פלסמידים המקודדים לחלבון P, בנפח כולל של 200 µL DMEM. במידה ונדרש להערכת יעילות הטרנספקציה (ואם אינו מופיע כבר בתוך מבנה האנטי-גנום הנגיפי), הוסף 100 ng של פלסמיד דווח פלורוצנטי.
      2. הוסף 18.6 µL של ריאגנט טרנספקציה ליפוזומלי, ערבב מיד על ידי ניעור קל של המבחנה, והדגר למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      3. [P] החלף את המצע ב-1.8 mL של DMEM, 2% FBS, 50 µg/mL kanamycin (או אנטיביוטיקה אחרת למניעת זיהום) לכל בארה, ולאחר מכן הוסף את תערובת הטרנספקציה בטפטוף לבארה וסובב בעדינות. הדגר את התאים למשך לילה ב-37 °C, 5% CO₂. החלף את המצע ב-2 mL של DMEM טרי, 2% FBS ו-50 µg/mL kanamycin למחרת; חזור על פעולה זו כאשר המצע הופך לחומצי.
         זהירות: [O] טפל בתאים ובחומרים בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית, שכן ייתכן נוכחות של נגיף מהטרנספקציה ועד לשלבים הבאים. השלך פסולת זיהומית (פוטנציאלית) באופן הולם.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של גנום נגיף החצבת. חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) מקודד ביחידת תמלול נוספת במורד רצף המנהיג (ld). N, P, M, F, H, ו-L מציינים גנים המקודדים את החלבונים המבניים של נגיף החצבת: נוקלאואפרוטאין, חלבון P, חלבון מטריקס, חלבון היתוך, חלבון המגלוטינין וחלבון גדול (פולימראז), בהתאמה, אשר מבוטאים באופן דיפרנציאלי כפי שמוצג לעיל. טרנסגן של מחבר תאי T דו-ספציפי (BTE) מוחדר ליחידת תמלול נוספת (ATU) במורד מסגרת הקריאה הפתוחה של H. הטרנסגן מקודד לפפטיד מנהיג של אימונוגלובולין קאפה (Igκ) להפרשה יעילה, וכן לתגי חלבון של המגלוטינין של השפעת (HA) והקסאהיסטידין (His) לצורך זיהוי וניקוי. גנים המקודדים לדומיינים של שרשרת כבדה משתנה (VH) ושרשרת קלה משתנה (VL) של נוגדנים המכוונים ל-CD3 ו-CD20, בהתאמה, מחוברים via רצפי מקשר פפטידיים המכילים שאריות גליצין (G) וסרין (S). לרצף הטרנסגן קודם רצף Kozak. במורד אזור הקידוד, נכללו נוקלאוטידים נוספים כדוגמה כדי לעמוד ב"כלל השש" (rule of six). קסטת ההחדרה מוקפת בשני אתרי הגבלה המאפשרים את ההחדרה ל-ATU המתאימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דה-פוספורילציה מהירה של DNA & ערכת ליגציה	Roche Life Science, מנהיים, גרמניה	4898117001
ערכת שיבוט PCR מסוג CloneJET	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
אגרוז	Sigma-Aldrich, טאופקירכן, גרמניה	A9539-500G
ערכה למיצוי ג'ל QIAquick	QIAGEN, הילדן, גרמניה	28704
E. coli מסוג NEB 10-beta כשירה	New England Biolabs (NEB), פרנקפורט/מיין, גרמניה	C3019I
QIAquick Miniprep Kit	QIAGEN, הילדן, גרמניה	27104
אנזים הגבלה HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), פרנקפורט/מיין, גרמניה	R3104S
מצע דאלבקו המודגש של איגל (DMEM)	Invitrogen, דרמשטאט, גרמניה	31966-021
סרום עגל עוברי (FBS)	Biosera, Boussens, צרפת	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, מנהיים, גרמניה	E2311	ניתן להחליף ברכיב טרנספקציה לפי הבחירה
קנמיצין	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה	K0129
תאי Vero	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81
פלטות בעלות 6 בארות	Neolab, היידלברג, גרמניה	353046