ייצור וקציר של תאי אפיתל טיפוליים המייצרים נגיפים

תקציר

קביעת היכולות השכפוליות והציטוטוקסיות של וקטורים ויראליים המקודדים אימונומודולטורים השוו את קינטיקת השכפול של הווירוס הרקומביננטי שנוצר ושל הווקטור שאינו משונה באמצעות עקומות גדילה (GCs) בצעד אחד או בריב-צעד. עבור עקומות גדילה בצעד אחד, צאצאי הווירוס מוערכים לאחר הדבקה סימולטנית של כל התאים (תיאורטית, 100% הדבקה). עקומות גדילה בריב-צעד מתחילות באחוז נמוך של תאים נגועים כדי לעקוב אחר מספר סבבים של שכפול ויראלי. לניתוח קינטיקת השכפול של נגיף החצבת (measles virus), זרעו 1 x 10^5 תאי Vero ב-1 מ"ל של DMEM (madium eagle modified by dulbecco) עם 10% FBS (נסיוב בקר עוברי) לכל באער בלוחות בעלי 12 באערים, יום אחד לפני ההדבקה. זרעו לפחות שני באערים עבור כל נקודת זמן רלוונטית כחזרות טכניות. הדביקו את התאים בווירוס ב-MOI (ריבוי הדבקה) נמוך עבור עקומות גדילה בריב-צעד, או ב-MOI גבוה עבור עקומות גדילה בצעד אחד (0.03 ו-3 עבור MV או נגיף החצבת), בהתאמה, לשכפול על תאי Vero. החליפו את המצע ב-300 µL של מצע נטול נסיוב המכיל את כמות הווירוס המתאימה, והדגרימו ב-37 °C וב-5% CO2 למשך לפחות שעתיים. הסירו את האינוקולום, הוסיפו 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, והמשיכו בדגירה. בנקודות זמן רלוונטיות, כגון 12, 24, 36, 48, 72 ו-96 שעות לאחר ההדבקה, אספו את צאצאי הווירוס על ידי גירוד ישיר של התאים לתוך המצע. העבירו את התוכן מכל באער לשפופרת נפרדת, הקפיאו באופן מהיר בחנקן נוזלי, ואחסנו ב-80°C- עד לביצוע הטיטרציה. הערה: ניתן לאחד דגימות חוזרות בשלב זה לצורך ניתוח של טיטרים ממוצעים. אספו דגימות מכל נקודות הזמן. הפשיתו אותן בו-זמנית ב-37 °C להערכת צאצאי הווירוס. ערבלו בוורטקס (Vortex) ושקיעו את שאריות התאים על ידי צנטריפוגציה למשך 5 דקות ב-2,500 x g וב-4 °C. חשבו את הטיטרים הממוצעים של כל מבנה (construct) ונקודת זמן כפי שתואר לעיל. שרטטו את הטיטרים לאורך זמן. השוו את עקומות הגדילה של וקטורים עם ובלי טרנסגנים מוכנסים, עם טרנסגנים שונים, או עם טרנסגנים שהוכנסו במיקומים שונים (ראו איור 1). Heidbuechel, J. P., ואחריםParamyxoviruses עבור אימונומודולציה המכוונת לגידולים: תכנון והערכה ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את תהליך ההדבקה של תאי אפיתל של הכליה בנגיפים שעברו הנדסה גנטית לצורך ייצורם ואיסופם לצורך חקר השכפול הנגיפי.

פרוטוקול

1. קביעת היכולות השכפוליות והציטוטוקסיות של וקטורים נגיפיים המקודדים למודולטורים של מערכת החיסון

השוו את קינטיקת השכפול של הנגיף הרקומיננטי שנוצר ושל הווקטור שלא עבר שינוי באמצעות עקומות גדילה (GCs) של שלב אחד או מספר שלבים. בעקומות גדילה של שלב אחד, צאצאים נגיפיים מוערכים לאחר הדבקה סימולטנית של כל התאים (באופן תיאורטי, 100% הדבקה). עקומות גדילה של מספר שלבים מתחילות באחוז נמוך של תאים מודבקים כדי לעקוב אחר מספר סבבים של שכפול נגיפי.

1. לניתוח קינטיקת השכפול של נגיף החצבת, זרעו 1 x 10⁵ תאי Vero ב-1 mL של DMEM (dulbecco’s modified eagle medium) עם 10% FBS (fetal bovine serum) לכל באר בלוחות 12-בארים יום אחד לפני ההדבקה. זרעו לפחות שתי בארות עבור כל נקודת זמן רלוונטית כחזרות טכניות.
2. הדביקו את התאים בנגיף ב-MOI (multiplicity of infection) נמוך עבור עקומות גדילה (GCs) רב-שלביות, או ב-MOI גבוה עבור עקומות גדילה חד-שלביות (0.03 ו-3 עבור MV או נגיף החצבת), בהתאמה, לשכפול על תאי Vero. החליפו את המצע ב-300 µL של מצע נטול סרום המכיל את כמות הנגיף המתאימה והדגירו ב-37 °C וב-5% CO₂ למשך 2 h לפחות. הסירו את האינוקולום, הוסיפו 1 mL של DMEM עם 10% FBS והמשיכו בדגירה.
3. בנקודות זמן רלוונטיות כגון 12, 24, 36, 48, 72 ו-96 h לאחר ההדבקה, אספו את צאצאי הנגיף על ידי גירוד ישיר של התאים אל תוך המצע. העבירו את התוכן מכל באר לשפופרת נפרדת, בצעו הקפאה מהירה (snap-freeze) בחנקן נוזלי, ואחסנו ב-80 °C- עד לטיטרציה.
   הערה: ניתן לאחד דגימות חוזרות בשלב זה לצורך ניתוח של טיטרים ממוצעים.
4. אספו דגימות מכל נקודות הזמן. הפשיתו אותן בו-זמנית ב-37 °C לצורך הערכת צאצאי הנגיף. ערבבו ב-Vortex ושקעו את שיירי התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה למשך 5 min ב-2,500 x g וב-4 °C.
5. חשבו את הטיטרים הממוצעים של כל מבנה (construct) ושל כל נקודת זמן כפי שמתואר לעיל. שרטטו את הטיטרים כפונקציה של הזמן. השוו בין עקומות הגדילה של וקטורים עם ובלי טרנס-גנים מוחדרים, עם טרנס-גנים שונים, או עם טרנס-גנים שהוחדרו במיקומים שונים (ראו איור 1).

תוצאות

איור 1: קינטיקת שכפול ופעילות ליטית של נגיפי חצבת רקומביננטיים. (A) עקומות גדילה של שלב אחד נוצרו לאחר הדבקה של תאי Vero בנגיף חצבת (MV) אנקולייטי לא שונה או בנגיף חצבת המקודד עבור T cell engager ביספציפי (MV-H-mCD3xhCD20) ב-MOI של 1. טרים של צאצאים נגיפיים הוערכו בנקודות זמן שנקבעו לאחר ההדבקה, המעידות על קינטיקת שכפול נגיפית דומה. מוצגים ממוצעים וסטיות תקן של שמונה דגימות (ארבעה חזרות טכניות לכל אחת משתי חזרות ביולוגיות לכל נקודת זמן). (B) חיוניות התאים הוערכה בתאי קרצינומה קולורקטלית עכברית MC38 המבטאים באופן יציב אנטיגן קרצינו-עוברי אנושי ואת קולטן ה-MV, CD46 (MC38-CEA-CD46), לאחר הזרקה של מצע בלבד (mock) או של נגיפים מצוינים ב-MOI של 1. בדיקת חיוניות תאים בשיטת XTT בוצעה בנקודות הזמן המצוינות. ירידה בחיוניות התאים נצפתה בנקודות זמן מוקדמות יותר עבור הווקטור שלא שונה. ערכים מעל 100%, כפי שחושבו עבור MV-H-mCD3xhCD20 בנקודת הזמן של 12 h, נצפים לעיתים קרובות זמן קצר לאחר ההדבקה, מה שעשוי לנבוע מסטרס תאי או מגורמים שמקורם בתאים המצויים בתליה הנגיפית. ערכי ממוצע פלוס סטיות תקן של שלוש חזרות טכניות מוצגים עבור כל נקודת זמן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	משמש לזריעה ולהדבקה של תאי Vero
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	להעשרה של DMEM
תאי Vero	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	תאי מאכסנת להרבה ובדיקה של נגיף החצבת
פלטות 12 בארות	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	לזריעת תאי Vero (1 × 10⁵ לבערה)
Opti-MEM (מצע נטול סרום)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	לשלב ההדבקה בנגיף (דגירה נטולת סרום)
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	לשטיפה ולהכנת מצע
גורף תאים (Cell lifter)	Corning, Reynosa, Mexico	3008	משמש לגריפת תאים נגועים בעת האיסוף
מבחנות 50 mL	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	לאיסוף דגימות ולסנטריפוגה
חנקן נוזלי	—	—	להקפאה מהירה (snap-freezing) של דגימות נגיפים שנאספו
סנטריפוגה (מסוגלת ל-2,500 × g)	—	—	לשקיעת שאריות תאים
XTT Cell Viability Kit (Colorimetric Cell Viability Kit III)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	כולל ריאגנט XTT; למדידת ציטוטוكسיות
פלטות 96 בארות, תחתית שטוחה	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	למדידת בליעה ב-450 nm
ספקטרופוטומטר / קורא מיקרופלטות	—	—	למדידת בליעה אופטית ב-450 nm (רפרנס 630 nm)
מדגרה לפחמן דו-חמצני	—	—	37 °C, 5% CO₂ עבור כל דגירות התאים