הערכת פעילות אימונומודולטורית של מעבּר תאי T דו-ספציפי (BTE) מקודד ויראלית

תקציר

מקור: Heidbuechel, J. P., ושותפיהםParamyxoviruses לאימונומודולציה המכוונת לגידולים: תכנון והערכה ex vivo. .J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת תאים להערכת הפעילות האימונומודולטורית הספציפית למטרה של bispecific T-cell engager (BTE) המקודד באופן ויראלי. ה-BTE מקשר בין תאי גידול המבטאים רספטור מטרה לבין תאי T, ובכך מעורר ליזיס של הגידול ושחרור אנזימים. קריאה קולורימטרית, המבוססת על המרת סובסטרט, מעידה על הפעלת תאי T. עוצמת צבע גבוהה יותר בדגימת הבדיקה מאשרת מעורבות חיסונית תלוית-רספטור המתווכת על ידי BTE.

פרוטוקול

1. הערכת התפקוד האימונולוגי של אימונומודולטורים מבודדים.
   1. להלן תיאור מפורט של אופן הערכת ציטוטוקסיות ממתווכי תאים המושרה על ידי bispecific T-cell engager (BTE) באמצעות בדיקת שחרור lactate dehydrogenase (LDH).
      1. קבעו את התנאים לבדיקה במהלך הניסוי (ראו Figure 1 כדוגמה). ניתן לגוון את נקודות הזמן (שעות עד ימים), ריכוזי האימונומודולטור (pg/mL עד µg/mL), ויחסי תאי אפקטור לתאי מטרה (E:T) (למשל, בין 1:50 ל-50:1). הכינו תמיד את הדגימות בשלוש חזרות.
      2. כללו דגימות ללא חלבון BTE וללא תאי אפקטור, בקרות לשחרור LDH ספונטני של סוגי התאים הבודדים (Tsp ו-Esp), בקרת ליזיס מקסימלי של תאי מטרה (Tmax) עם הוספת דטרגנט לפני הקריאה, בקרת מדיום בלבד, ובקרת נפח עבור Tmax.
         הערה: מספר תאי המטרה הדרוש וזמני האינקובציה עשויים להשתנות. בצעו הרצות בדיקה ראשוניות ללא תאי אפקטור ואימונומודולטורים כדי לזהות את הפרמטרים האופטימליים. כללו דגימות Tsp ו-Tmax ובקרות תואמות כדי להעריך מספרים שונים של תאים ונקודות זמן.
      3. בודדו תאי אפקטור אימוניים (למשל, על ידי סנטריפיגציה במדרג צפיפות של דם אנושי לקבלת תאים מונונוקליאריים של דם פריפריאלי (PBMCs) או סלקציה שלילית של תאי T עכבריים מספלנוציטים של עכבר).
      4. זרעו תאי מטרה (למשל, 5 x 10³ למבורה) בפלטת 96-well בעלת תחתית U.
      5. הוסיפו את החלבון המבודד בריכוזים הרצויים לדגימות הרלוונטיות. הוסיפו תאי אפקטור אימוניים ביחסי המבוקשים. הוסיפו מדיום עד לנפח כולל של 100 µL למבורה.
      6. דגרו למשך פרק הזמן שנקבע, בדרך כלל בין 4 ל-48 h (24 h עבור PBMCs שאינם מעוררים ו-48 h עבור תאי T עכבריים שבודדו זה עתה; זמני דגירה קצרים יותר עשויים לחול על תאים אימוניים שעוברו סטימולציה מוקדמת), ב-37 °C ו-5% CO₂.
      7. 45 דקות לפני איסוף הדגימות, הוסיפו 10 µL של תמיסת ליזיס 10x למבובות המכילות דגימות Tmax ולבקרות המדיום התואמות. המשיכו בדגירה.
      8. שקעו את התאים בסנטריפיגציה ב-250 x g למשך 4 min. העבירו 50 µL מכל עלון לפלטת 96-well בעלת תחתית שטוחה. אין להעביר תאים כדי למנוע LDH קשור לתאים.
      9. הכינו את תמיסת הסובסטרט לפי הוראות היצרן. הוסיפו 50 µL לכל מבורה ודגרו בטמפרטורת החדר [RT] בחושך למשך 30 min או עד שדגימות Tmax הופכות לאדומות כהות.
      10. הוסיפו 50 µL של תמיסת עצירה לכל מבורה. הסירו בועות אוויר על ידי סנטריפיגציה למשך 1 min ב-4,000 x g, ובצורה ידנית באמצעות מחט חלולה. מדדו בולעניות אופטית ב-490 nm.
      11. חשבו את ערכי אחוזי הליזיס הספציפי עבור כל דגימה.
          1. חשבו ממוצעים עבור חזרות של בקרות מדיום עם ובלי תמיסת ליזיס. חסרו את הערכים שהתקבלו מהדגימות הניסיוניות ומבקרות Tmax ושחרור ספונטני, בהתאמה. השתמשו בערכים מתוקנני רקע אלה לחישובים נוספים.
          2. חשבו ממוצעים עבור בקרות Tmax, Tsp ו-Esp מתוקנני רקע. באמצעות ערכי ממוצע אלו, המשוואה הבאה תיתן את אחוז הליזיס הספציפי לכל דגימה:
             
          3. שרטטו את ערכי אחוזי הליזיס הספציפי אל מול ריכוז החלבון או יחס ה-E:T והשוו לדגימות הבקרה שאינן מכוונות למטרה.

תוצאות

איור 1: פעילות ציטוטוקסית של BTEs המקודדים על ידי נגיף החסבת. תאי גידול מטרה (5 x 10³ תאי B16-CD20-CD46 לבאר) דגרו עם תאי T עכבריים ביחס של 1:50. BTEs (מפעילים דו-ספציפיים של תאי T) שנוקו בעבר מהעליון של תאים מזוהמים ב-MV(Measles virus)-H-mCD3xhCD20 הוספו בריכוזים המצוינים. ליזיס יחסי של תאי המטרה הוערך באמצעות בדיקת שחרור LDH לאחר 48 h. תאים שחסר בהם האנטיגן מטרה של ה-BTE (תאי B16-CD46) שימשו כייחוס להערכת ציטוטוקסיות ספציפית לאנטיגן. מוצגים ממוצעים פלוס סטיות תקן של שלושה חזרות טכניות לכל דגימה. תאים המבטאים את האנטיגן מטרה עברו ליזיס ספציפי באופן התלוי בריכוז ה-BTE. טוהר מוצר ה-BTE ורמות ביטוי האנטיגן מטרה משפיעים על הריג ה תאים. בדוגמה הנוכחית, הושגה הרגה ספציפית של 15% בריכוז BTE גבוה יחסית של 1 µg/mL. זהו ערך טיפוסי להגדרה ניסיונית כזו עם זמני דגירה משותפת ארוכים ותנאי תרבית תאי T סוב-אופטימליים. בהגדרות אחרות, הושגה הרגה ספציפית של עד 60% באמצעות BTEs שנוקו מעליונים מזוהמים ב-MV, והגיעה למישור (plateau) בריכוזי BTE של 100 ng/mL ומעלה. הדבר מעיד על כך שבניגוד לאינטואיציה, הגבלה זו של הבדיקה היא פחות מ-100% הרגה ספציפית, דבר שניתן להסביר באמצעות קינטיקת גדילה שונה בביקורות Tmax בהשוואה לדגימות של תרבית משותפת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוכ מודגש של איגל בשינוי דולבקו (DMEM)	Invitrogen, דרמשטאט, גרמניה	31966-021
סרום עוברי בקר (FBS)	Biosera, Boussens, צרפת	FB-1280/500
קנמיצין	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	ג'. היידבואכל, DKFZ היידלברג		זמין על פי בקשה
ערכה קולורימטרית לבדיקת חיוניות תאים III (XTT)	PromoKine, היידלברג, גרמניה	PK-CA20-300-1000	כולל ריאגנט XTT
מלח פוספט רב-ערכי של דולבקו (PBS)	Gibco Life Technologies, דארמשטאט, גרמניה	14190-094
עמודי ספין QIAquick Ni-NTA	QIAGEN, הילדן, גרמניה	31014
פלטות 96 בארות, תחתית U	TPP, טראסדינגן, שווייץ	92097
פלטות 96 בארות, תחתית שטוחה	Neolab, היידלברג, גרמניה	353072